杨民医生的科普号

目的：探讨大鼠滑膜间充质干细胞（Synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSC）生物学特性及诱导成骨的可行性，以及SMSC复合羟基磷灰石/壳聚糖/聚乳酸（Hydroxylapatite/Chitosan/Poly L-latic acid,HA/CS/PLLA）骨修复材料在体内异位成骨的可行性。方法：采用酶消化法和贴壁法进行培养和纯化SMSC，提纯后的SMSC流式细胞仪检测，将SMSC成脂肪、成骨诱导，分别进行油红O染色、茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）染色。成骨诱导不同时间段分别利用实时定量PCR检测OCN、ColⅠ、ALP、RUNX2表达情况，Ellisa法测量ALP活性和细胞基质钙含量。取第三代SMSC接种于HA/CS/PLLA支架材料，将支架材料植入大鼠下肢肌袋内，4周和8周后观察体内成骨的情况。结果：提纯后滑膜间充质干细胞CD147、CD90、CD105、CD44呈阳性表达（＞95%），而CD117、CD34、CD14、CD45则呈阴性表达（＜10%）；油红O染色可见红色脂滴形成、茜素红染色可见红色钙化灶和ALP染色可见胞质咖啡样深染；SMSC成骨诱导后OCN、ColⅠ、ALP、RUNX2表达均为阳性；ALP活性在第7d达到峰值（P＜0.05），钙含量随诱导时间的增加而增加（P＜0.05）。4周和8周影像学和组织学结果显示，各组均可见新生骨形成，而SMSC-HA/CS/PLLA材料组较单纯HA/CS/PLLA材料组成骨量多（P＜0.05）。结论：SMSC经成骨诱导后具有成骨细胞特征，在体内也能形成新骨，可成为骨组织工程的种子细胞。

颈椎间盘组织突破后纵韧带游离位于硬膜外压迫脊髓或神经根而出现颈肩疼痛及四肢无力的临床症状，通常称为硬膜外型椎间盘突出（epidural cervical discextrusion, ECDE）[1]。文献报道外伤是导致硬膜外型颈椎间盘突出的一个重要原因，非外伤退变性硬膜外型椎间盘突出则少见[2]。此外，硬膜外型椎间盘突出穿破后纵韧带到达硬膜外后，游离的髓核通常位于椎间隙水平，而移位到椎体后方的病例则更为罕见，定义为非创伤硬膜外游离型颈椎间盘脱出。1 资料与方法1.1 一般资料 本组10例，男6例，女4例；年龄42~65岁，平均48.2岁；病程1个月~4年，平均15个月。本组患者均无外伤史，均有不同程度的四肢麻木、无力、行走不稳及括约肌功能障碍。3例患者同时有明显的颈肩部疼痛。术前患者JOA评分为7.2±1.55。所有患者接受颈椎X片、CT和MRI检查。10例中，脱出游离髓核位于C3,4 2例，C4,54例，C5,6 3例，C3,4及C4,5双间隙1例。所有病例中，游离于椎体后方的髓核在T1相上和相应病变椎间隙等信号，而在T2相上为等或高信号。T1加权像上可见后纵韧带被髓核穿过的条状阴影，髓核表面不光滑且不规整，与脊髓之间界限不清。2例患者术前MRI受压节段脊髓T1相等信号，T2相高信号。1.2入选标准[3] 1）游离的颈椎间盘髓核位于病变椎间隙上或下方椎体的后方；2）矢状面上，脱出游离的髓核压迫硬膜囊导致硬膜下腔完全闭塞，且髓核到达椎体后中部水平；3）矢状面上，髓核从前方压迫脊髓导致前后径小于8mm。1.3排除标准[3] 1）脱出游离的髓核仅位于病变椎间隙者；2）髓核游离至颈脊髓的背侧或突破硬膜疝入髓内；3）CT证实致压物为增生骨赘。1.4 手术方法 所采用的术式均为颈前路椎体次全切除合并后纵韧带切除髓核摘除减压内固定。术中行椎体次全切除减压，直视下充分显露后纵韧带。若能清楚辨明后纵韧带上髓核穿破口和疝入的髓核蒂部，则用神经剥离子钩沿此破裂口细心分离扩大破口并轻轻提起韧带，并用超薄枪钳细心咬除韧带，并轻轻取出脱出游离于后纵韧带下方的髓核组织。若髓核在后纵韧带上穿过的破口已愈合，后纵韧带光整，则将小型神经剥离子钩沿韧带走行方向上从近端椎体外侧薄弱处细心钩入韧带下，然后轻轻旋转90度并提起，用尖刀轻柔地沿剥离子钩的纵向沟槽横行切开后纵韧带，再以超薄枪钳细心咬除韧带并取出游离髓核。后纵韧带完整切除后可细心探查减压节段有无遗漏的游离状小的髓核碎片，彻底减压后，减压节段硬膜立即膨隆且恢复搏动。本组有3例术中发现游离于椎体后方后纵韧带下的髓核为多个碎片状，其余7例为整块游离的髓核组织。这些游离的髓核组织及碎片表面多光滑，和后纵韧带及硬膜囊无明显的粘连，易于取出。术毕，术中所摘除的髓核组织送病理检查证实为髓核组织，且终板及纤维环组织很少。1.5 观察项目与方法 按照日本骨科学会JOA评分标准[4]，在术前及术后随访时由2位未参加治疗的骨科医师进行神经功能评分（上下肢运动功能各4分，感觉功能6分，膀胱功能3分，共17分）。按评分计算改善率而评定手术效果：神经功能改善率=[（术后分－术前分)/(17分－术前分)]×100﹪，JOA评分改善率75%以上者为优；50%～74%为良；25%～49%为可；25%下为差。1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，术前及术后随访的JOA评分用x±s表示，采用配对t检验进行进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果本组10例均获得随访，时间15~32个月，平均21个月。平均手术时间（160±22）min，失血量(320±30)ml。所有患者颈部手术切口一期愈合，无脑脊液漏，感染及血管、气食道损伤等并发症。X线平片定期复查，无内固定松动和失效。术后颈椎MRI检查时间在术后3个月以上，脊髓形态饱满、平滑，减压节段及减压临近节段无压迫。 脊髓功能恢复情况：JOA评分由术前的7.2±1.55提高至术后的13.6±1.90，术前和术后JOA评分差异有统计学意义（见表1），改善率66.7﹪，疗效评定优3例，良6例，可1例。3 讨论3.1 发病率及发病机制 在外伤和退变的情况下，突出的间盘组织突破后纵韧带而游离位于硬膜外形成硬膜外型椎间盘突出压迫脊髓和神经。张佐伦等[1]报道400例颈椎病患者中ECDE占24.3%。国外Bertalanffy等[4]报道ECDE的发生率则高达35%，作者推测可能和纳入统计的患者标准不一所致。有学者统计27~100%患者发病前有颈部外伤史，推测在颈椎间盘退变的基础上，外伤可导致椎间盘纤维环破裂，压力大的髓核突出，可穿破较薄弱的后纵韧带全层猛然突出而到达硬膜外腔，并与纤维环内髓核组织分离，可向椎管内或椎间孔内任何方向移动。相反，退变性ECDE中，病程进展缓慢，无外伤史[2]。国外学者认为存在两种ECDE[3]：即髓核突破后纵韧带到达硬膜外腔后停留于椎间隙水平而不上下游离；或髓核向上下游离到椎体后方，达椎体高度的一半即NTSEMCDE。目前英文文献仅有18例NTSEMCDE病例报道，Carviy Nievas等[5~9]回顾性分析了这18例临床特点和手术治疗方案。综合文献和我们所报道的共28例患者的临床特点，我们分析产生这种类型颈间盘脱出的可能原因是：1）患者原有颈椎退变，髓核脱出穿越后纵韧带并停留在椎间隙水平相应的硬膜外腔。游离型髓核通过血管化及凋亡等因素为机体逐步吸收而缩小或裂解为多个髓核碎片，这些缩小和裂解的髓核碎片较大块髓核更容易上下潜行而到达椎体后方。2）通常有明确外伤史的ECDE及时就诊，发现压迫通常手术治疗，缺失连续动态追踪的机。 3.2临床特点及MRI诊断 NTSEMCDE患者发病时间相对较长，椎间盘突出穿破后纵韧带到达硬膜外后，继续移位到椎体后方。因病程长久，退变因素持续存在，突出物通常较大，压迫硬膜囊前方导致脊髓前动脉或沟动脉损伤致脊髓前角和灰质联合部位缺血缺氧，致脊髓功能受损，临床表现为脊髓受压椎体束症状。脱出髓核如位于侧方，则表现为典型的脊髓半切综合征。因此，通常从患者临床表现很难将常见的颈椎间盘突出症和NTSEMCDE进行区分。但是，该类型间盘脱出因和常规突出有着不同的疾病机理，因此其颈椎MRI有着独特的信号改变，是判断该类型脱出的最佳方法。我们观察到在本组10例中，在T1失状位上可清楚判断游离移位到椎体后方的髓核组织，这些髓核组织和其母核椎间隙的信号是一致的等信号。同时，也能大致判断椎体后方游离髓核碎片的数目。而轴位相则可显示髓核压迫脊髓的位置和压迫的程度。失状位T2相则显示椎体后方团块状等信号或高信号影，但不能判断这些就是游离髓核组织。3.3 临床治疗 保守治疗：腰椎的研究结果表明，游离型、穿破后纵韧带、脱出越大且髓核成分越多的椎间盘越容易吸收。其机理可能是通过免疫炎症反应、再血管化和凋亡等途径促进间盘的吸收。腰椎间盘突出后的再吸收现象为某些类型的腰椎间盘突出的保守治疗提供了理论依据。据此，本文所报道的颈椎游离髓核具有游离移位距离大、突出大、穿破后纵韧带、髓核成分为主等临床特点，推测自然吸收的可能性较大。但是，因颈椎和腰椎的解剖环境不同，通常学者持颈椎间盘突出造成的脊髓受压功能受损宜早期减压以挽救脊髓功能的观点，晚期减压可能会导致脊髓功能不可逆，因此，文献报道颈椎间盘突出通过保守治疗而自然吸收的报道相对较少。Shimomura等[10]通过对56例非手术治疗的脊髓型颈椎病患者进行回顾性调查研究表明，对于轻度（术前JOA评分13～17分）脊髓型颈椎病患者通过保守治疗可以获得良好的临床疗效，而对于存在MRI轴位上脊髓有环状受压、硬膜下腔消失的轻度患者则需手术治疗。本组10患者术前JOA评分为10分以下，故不适宜采用保守治疗，手术治疗为首选。本组手术后随访终点的JOA评分为13.6±1.90较术前7.2±1.55明显提高，平均改善率为66.7%。而Srinivasan[3]则报道该类型患者因拒绝手术治疗造成临床症状恶化。手术特点：我们总结NTSEMCDE前路手术有以下一些特点：1：因游离脱出的髓核位于椎体的后方，行前路椎体次全切除复合后纵韧带切除减压植骨内固定术可充分显露椎体后方的后纵韧带并切除后纵韧带则可完整而无遗漏地摘除所有游离的髓核组织，从而达到彻底减压的目的。2：后纵然带需切除[11]：彻底切除后纵韧带可充分显露并摘除游离的髓核块，有时术前MRI显示为一整块的髓核影像，而术中切开后纵韧带则观察到为数块游离的髓核碎片。不做韧带切除容易遗漏，难以做到彻底减压。此外，某些病例中，髓核穿破后纵韧带的破裂口再次愈合，如不切除后纵韧带行硬膜外腔探查，亦造成遗漏。3：后纵韧带切除的注意事项：如能观察到髓核穿过后纵韧带的破口，则采用小型神经剥离子沿破口扩大并配合超薄枪钳逐步咬除韧带。若髓核在后纵韧带上穿过的破口已愈合，后纵韧带光整，则将小型神经剥离子钩沿韧带走行方向上从近端椎体外侧薄弱处细心钩入韧带下，然后轻轻旋转90度并提起，用剪刀轻柔地沿剥离子钩的纵向沟槽横行切开后纵韧带[11]，再以超薄枪钳细心咬除韧带并取出游离髓核。因本组10例均为软性游离椎间盘突出，无明显的后纵韧带肥厚、骨化，且术中所取的游离髓核组织和硬膜囊及后纵韧带均无明显的紧密粘连，只要细心操作，保持良好的照明和引流，操作并不困难。本组无一例出现硬膜破损及脑脊液漏的出现。相反，文献报道[12]部分硬膜外型间盘突出后髓核和硬膜粘连很重，需要显微切除。我们分析其可能的原因是外伤所致的硬膜外型椎间盘突出物不仅包含髓核，可能有部分终板及纤维环组织，这些突出物和单纯髓核突出后的组织学表现可能不一。其次，突出物可能并非软性间盘突出，如存在硬性突出致压，则突出物和硬膜粘连较重。4：NTSEMCDE合并其他节段退变的术式选择：通常对于3节段及以上椎间盘突出及发育性颈椎管狭窄患者而言，后路椎板开门成型手术是其适应症。但是，对于本型ECDE而言，后路椎板成型术后脊髓向后退让并不能缓解游离髓核对脊髓的压迫，Srinivasan等[3]报道的一例行后路椎板成型手术后，疗效欠佳且神经功能恶化病例, 佐证了上述观点。基于此，本组1例患者ECDE合并相邻节段椎间盘退变，我们则采取开槽切骨减压同时行相邻节段单间隙间盘摘除减压植骨固定。手术顺利，恢复良好。总之，对于该类临床上较少见的游离至椎体后方的硬膜外型颈椎间盘突出的患者，术前仔细阅读颈椎MRI，如在失状位T1相上发现椎体后方较大的团块状髓核组织，且这些髓核组织和其母核椎间隙的信号是一致的等信号，则基本可以确诊为游离硬膜外型颈椎间盘突出症。宜早期行颈前路椎体次全切除并后纵韧带切除减压内固定手术，完全切除游离的整块和碎裂髓核而彻底减压是手术治疗成功的关键。

近年来，涉及生命科学和工程学的骨组织工程学技术已成为骨修复重建领域的重要研究方向。研究者通常采用分离自体间充质干细胞在体外扩增并向成骨诱导培养后和支架材料复合后构建组织工程化骨植入体内。但是这种方法的关键在于如何通过细胞培养获得足够量的成骨种子细胞，此外种子细胞在体外长期扩增和诱导培养过程中细胞表型特征的维持都是尚待解决的难题。近年来，从抽吸的脂肪组织中提取的多潜能细胞作为种子细胞在组织工程应用中取得了极大的成功。目前，脂肪组织是人体储量最大、最易于获取和取材应用的组织，具有很大的临床应用前景。然而，通过基因修饰途径定向诱导成骨分化存在病毒载体的应用安全性和基因表达时空调控等诸多问题，而通过成骨化学试剂诱导成骨分化存在诱导和培养时间较长，细胞受污染和细胞表型转化的风险，这些都限制了其可能的临床应用。研究结果表明，PRP组在诱导后14天ALP活性即达到高峰值，而对照组则在诱导后18天达到高峰值，且前者高峰值明显高于后者的高峰值。而两组各个对应时间点 ALP活性中也有显著性差异，即前者明显高于后者。而通常认为，ALP是成骨细胞分化的一个早期标志，ALP在体外钙化中起着关键性作用，在成骨前体细胞即开始表达，在过渡型成骨细胞和分泌型成骨细胞中ALP活性进一步增加，但在成熟的成骨细胞中ALP活性呈下降趋势，其水平的高低和细胞的分化程度相关。因此，ALP 活性的高低能比较客观地反映细胞向成骨细胞转化的趋势。我们分析PRP 促进ADSCS的ALP 活性增加的原因可能是因为成骨诱导培养液中的地塞米松在提高细胞碱性磷酸酶含量的同时，PRP所释放的TGFβ类细胞因子可以刺激间充质细胞的增殖与分化,促进成骨细胞的增殖。细胞在增殖的同时，细胞膜结合蛋白ALP 也会随之增加。在随后的细胞矿化结节的检测中，我们发现体外培养14d的细胞/载体复合物通过切片VonKossa染色显示两组载体的孔隙内衬面呈多层黑染状，提示有大量钙盐的沉积，而PRP组的钙盐沉积含量高于对照组。ALP的活力是启动细胞钙化的一个关键，也和ALP活力高低明显相关。其主要机理是ALP 能够水解有机磷酸酶, 使局部PO+4 浓度升高, 并可破坏钙化抑制剂, 从而启动钙化。而在诱导培养14d时，PRP组细胞ALP活力明显高于对照组，故反映在其钙盐沉积的含量显著高于对照组。总之，本实验研究结果表明，PRP可有效地促进体外细胞快速发生成骨细胞表型转化，显著提高细胞ALP活性并增加细胞矿化细胞外基质的能力。基于此，该改良细胞体外培养方法可加少细胞体外培养的时间，减少体外操作的污染可能，同时也减少细胞长时间培养后表型转化的风险，具有较大的临床意义。而进一步的体内移植试验则需要优化载体的设计、调整细胞/载体复合的比例，以期获得更好地体内成骨效果。

随着数字化影像技术的不断发展，许多数字化设备的软硬件技术被广泛应用于临床。由于每种成像模式成像原理不同，使得信息采集点也存在差异。依据成像原理的不同，医学成像模式大体可分为两类: 一是功能成像，包括正电子发射断层成像( PET) 、单光子发射断层成像( SPECT) 等。二是解剖成像，包括磁共振成像( MRI) 、计算机断层成像( CT) 以及X射线成像等，它们产生形态学图像。在临床骨科中，单一成像已难以满足临床诊断的需要，所以功能成像和解剖成像的结合是目前的发展趋势，由此促进了医学图像融合技术于20 世纪90 年代迅速发展［1］，整合了功能影像与解剖影像的优点，为临床骨科诊断提供更全面的医学信息。1 医学图像融合的原理医学图像融合是指对医学影像信息，X 线、CT 和MRI 等解剖成像与SPECT、PET 等功能成像利用计算机软件将之融合，实现多信息的同步可视化，对相关医学影像起到互补的作用［2］。医学图像融合技术的一个完整的系统是由医学成像及处理设备与融合软件的相结合［3］。图像融合技术是把采集自不同时间、设备的图像，在空间上配对、整合，通过在两幅图像数据集上寻找某种几何变换关系，将一幅图像数据的坐标转换到另一幅图像坐标系中去，使它们之间的空间位置达到匹配［4］。图像融合技术的过程为:特征提取、图像数据处理、误差评估、图像数据进行对位、分析数据。而对位是图像融合技术的关键和难点。2 图像融合在骨科的应用2． 1 PET 与CT、MR 相融合2． 1． 1 PET-CT Townsend 等［5］在1999 年美国核医学年会上首先报道了他们研制的PET-CT 机，Townsend 的PET-CT 一次检查就可获得PET 与CT 的相融合图像。这样使CT 图像与PET 图像不仅能够得到准确地匹配，且为PET 图像提供了一种更为精确而快速的衰减校正方法。其特点: 常规骨平面显像对少发病灶( 1 或2 枚) ，以及核素摄取轻度异常的多发性、局限性病灶的定性( 良、恶性) ，都缺乏特异表现［6-7］。通过CT 图像与PET 显像的融合，可更好的帮助临床医生提高肿瘤的特异性诊断。Even-Sapir E 等报道: PET-CT 对骨转移瘤，诊断敏感性为100%，特异性为88%，无论是溶骨型肿瘤还是成骨型的［8］。其优势: 对比传统的单一影像学诊断，PET-CT 具有以下明显优势［9-10］，( 1) 定位精确; ( 2) 通过精确定位，减少周围正常组织器官照射剂量，且肿瘤区域给予足够高的治愈剂量;( 3) 肿瘤较活跃部位能够精确显示，且定位活检精确。2． 1． 2 PET-MR 相比PET-CT，PET-MR 的研究更加令影像医生期待，因PET-MR 除具有PET-CT 的优点外，还可以提供更多的软组织信息，这样，其信息可应用于高精度的PET 图像衰减校正，更进一步提高图像质量和空间分辨率。现今，美国已成功将PET 晶体置入MR 内部，并已获得了大鼠脑部同机融合图像［11］，在国外已经用于临床，在国内将于今年年底装机投入使用，相信PET-MR 很快在国内应用于临床。2． 2 SPECT 与CT、MRI、DR 图像相融合及X 线断层融合2． 2． 1 SPECT-CT 单一的单光子发射计算机断层骨显像提高了诊断的灵敏度，对辨别病灶的解剖部位缺乏准确性［12］。通过对CT 的解剖定位功能以及CT 的诊断功能，加之SPECT的诊断灵敏度，其相融合后进一步增加了诊断骨骼病变的准确性［13-14］。恶性肿瘤一般以组织病理学结果为诊断的“金标准”。但若对全部病灶均获得病理学结果是不切实际的［15］。随着当今社会人类恶性肿瘤发病率的增加，而医疗水平不断发展，治疗方案不断完善，肿瘤患者生存期的延长，恶性肿瘤发生骨转移的机会也明显增加。据报道，骨转移瘤占全身转移性肿瘤的发生率由5%左右增加到目前的15%～ 20%，列第3 位，仅次于肺和肝转移［16］。对于骨骼系统，转移性骨肿瘤的发病率是原发恶性骨肿瘤的35 ～ 40 倍。脊柱为转移瘤的常见部位，约占骨转移瘤的90%［17］，其中又以胸腰椎多发灶多见，约为75%和63%［18］。在骨平面显像中，尤其是脊柱、胸廓前后骨的重叠; 好发于椎体边缘的骨赘、椎小关节增生等因素所导致的生理性摄取增高与好发于椎体或者椎弓根部位的肿瘤骨转移病灶所导致的病理性的异常摄取难以区分和鉴别，因此SPECT-CT 对其具有高敏感性和低特异性［19］。在恶性肿瘤患者中，通常会伴有一定程度的脊柱退行性变，多数转移灶和退行性改变的病灶在全身骨显像均可表现为异常浓聚灶。因此SPECT 对这些病灶定位的准确性降低。在此同时获得CT 与SPECT 成像，依靠CT 图像的诊断功能，借助其良好的空间分辨率和密度分辨率，将使定位更加准确，使融合图像能够清晰显示浓聚病灶位于骨皮质或髓质。同时CT 图像还可以准确显示溶骨和成骨性改变，为明确诊断提供重要的信息，对常见的易与肿瘤骨转移相混淆的退行性病变有着较好的识别能力［20］。SPECT-CT 显像的还有另一个特点是可以发现一些平面显像难以显示的、放射性分布轻度异常的病灶，通过病灶部位形态变化与局部骨质代谢异常信息的结合，较单纯的SPECT或CT 检查提供更加丰富的诊断信息，有利于提高诊断的准确性［21］。所以CT 的解剖和定位，能明确部分病变的良恶性质，再与具有灵敏优势的核素断层影像融合分析，可产生更为精确的诊断效能，使得骨扫描检查的临床应用价值明显提高［22］。SPECT-CT 显像根据全身骨显像异常浓聚的部位，可精确地进行局部SPECT-CT 显像，可有效减少患者辐射剂量，提高了诊断的特异性［23-24］。2． 2． 2 SPECT-MRI SPECT-MRI 融合图像在于早期准确判断病变的功能和代谢性变化，为临床治疗提供客观依据，并可能判断其预后的客观指标，尤其是在骨骼肌肉系统中应用也逐渐广泛，因为它实现了功能图像和解剖图像的对位与融合，既能观察软组织的解剖结构，也能对其功能、代谢情况做出了评价，尤其是骨坏死、骨的无菌性炎症以及骨关节炎等。从而能够对病变部位精确定位、定性，达到早诊断、早治疗的目的［25-27］。2． 2． 3 SPECT-DR SPECT-DR 对骨与关节骨折的诊断和预后的评估提供重要的依据，其一关节周围骨折，如髋臼缘的损伤、隐形骨折等，张敏等［28-29］行SPECT-DR 图像融合后证实其骨折，为临床骨科的诊断提供重要的依据，并减少了临床漏诊和误诊的发生。其二，在对骨折愈合方面，张敏等［30］ 行SPECT-DR 图像融合能够为临床骨科带来客观评价骨折愈合的方法，来判断其骨折愈合的程度，必要时结合SPECT-MR，显示骨折部位的血流分布，以及骨质代谢活跃度的变化，骨折部位代谢、血供和成骨过程的变化，骨显像均有异常发生，所以SPECT-DR 并能够更好的为临床骨折治疗制定科学的方案和确切的依据。2． 2． 4 X 线断层融合技术在骨折及骶尾骨中的应用断层融合技术即“数字连续断层融合技术( Digital Tomosynthesis，简称DTS) ”，是数字合成X 线体层成像［31］，可以在一次低剂量曝光后获取所扫描物体多个角度的投影数据，利用计算机重建技术获得任意层面、数目的图像，还可以清楚显示被检部位内部结构和周围组织结构的关系，使每一层层面都能清晰的显示而不受周围重叠组织影响，对于观察骨骼、胸部等对比明显的组织器官有独到之处［32］。对骶尾骨骨折的诊断，目前常规均行骶尾骨X 线正侧位片检查，但由于正位片骶尾骨与前方的直肠等盆腔器官重叠，侧位片骶尾骨中上部与髂骨重叠，下部骨质相对较薄与臀肌重叠和体外空气的影响，使骶尾骨显示不清晰，特别是不易显示非移位的骨折线［33］，故极易造成骶尾骨骨折的漏诊。据文献报道，普通X 线平片骶尾骨骨折的误诊、漏诊率高达61%［34］。断层融合成像技术不仅能够清晰显示骶尾骨，还能够清晰显示其他不规则骨的解剖结构、隐形骨折、骨折石膏固定后复位情况的判断、人工关节的随访、关节炎评估，在胸部部位的显示上亦有很大的临床价值［35-43］。

肱骨髁间骨折常有骨折块的旋转及关节面的严重损伤并可能伴有周围血管和神经损伤，是临床骨科较难治的一种骨折。以往的非手术治疗难以达到满意的复位和早期功能锻炼，从而使肘关节功能大部分丧失，因此肱骨髁间骨折的治疗结果并不十分满意。由于内固定技术的不断发展及治疗经验的不断积累，开放复位内固定治疗肱骨髁间骨折能使关节面达到准确的解剖复位并能进行早期肘关节功能锻炼，因此该技术已逐渐显示其巨大的优越性，并在临床实践中取得了满意的结果。本组手术治疗10例患者的优良率达到80%，亦验证手术内固定的优越性。肱骨髁间骨折是一种严重的肘部创伤, 骨折多为粉碎性, 可发生在冠状面、失状面和横断面上，关节软骨面完整性破坏，且常伴有关节囊和周围的血管神经组织广泛受损。因此，对于开放（或闭合）骨折同时伴有血管神经损伤的应急诊行骨折复位固定、血管神经探察修复术，以最大限度的挽救血管神经和肘关节的功能。对于闭合骨折而不伴有血管神经损伤者，应尽量在出现张力性水疱之前软组织肿胀相对较轻的情况下手术治疗。如患者就诊时肘部肿胀明显，或出现了张力性水疱，则应积极消肿，力争在伤后1周内手术治疗。有学者认为伤后24 h内手术患者比超过1周接受手术治疗的患者优良率明显增高，可能和早期手术治疗解剖结构相对清晰而易于解剖复位并进行功能锻炼有关。因此, 笔者认为肱骨髁上骨折应视同急诊手术，如合并全身其它器官严重创伤者也应积极治疗，争取在1周内施行内固定。对于无治疗条件的医院而言，应及时转送至有条件的上级医院治疗, 以免延误最佳治疗时机。

在外伤和退变的情况下，当突出的颈椎间盘组织较大且同时偏一侧突出时，则会出现BSS，这是由脊髓传导束的内在解剖特点所决定的：脊髓前索和外侧索中的皮质脊髓束和在脊髓内交叉的脊髓丘脑束受压分别导致损伤节段平面以下同侧运动功能障碍和对侧温痛觉障碍，后索受累则导致位置和振动觉障碍[1-4]。自Stookey于1928年首先报道一例颈椎间盘突出导致BSS病例以来，英文文献共报道39例此类病例[4]，而国内部分学者自2007以来共报道25例[5,6]。Jomin等[7]统计其患病比例为2.6%，但其未提供详细的病例数，Choi等[1]报道为0.21%（5/2350，）国内杨海松[6]统计为4.0%(15/372)。英文文献中Jomin[7]等报道了2例颈部外伤导致髓核疝入硬膜囊型BSS，占5.1%。我们推测在颈椎间盘退变的基础上，外伤可导致椎间盘纤维环破裂，压力大的髓核突出，可穿破较薄弱的后纵韧带全层而到达硬膜外腔，可与纤维环内髓核组织分离后向椎管内任何方向移动。后纵韧带骨化则可造成与之接触的硬膜囊长期受慢性应力刺激而造成硬膜囊和后纵韧带紧密粘连且脆性增加，如暴力强大髓核则可突破硬膜囊进入脊髓内[8]。国内民众有颈肩部不适而寻求推拿按摩的习惯，因此相关从业人员对此疾患应有一定的认识。对于非创伤性的BSS，我们分析产生这种类型的可能原因是：患者原有颈椎退变，在反复的颈椎活动应力作用下，髓核脱出穿越后纵韧带并停留在椎间隙水平相应的硬膜外腔。而在颈椎管狭窄的患者中，因椎管储备间隙明显减小，脊髓不能耐受髓核的压迫而表现症状。本组8例患者中，平均术前椎管失状径和椎体失状径之比值为0.72而小于0.75，提示有椎管狭窄。在英文文献报道的39例病例临床资料，患者发病平均年龄为47岁（25~73岁），其中男性28名，女性11名。34例为单间隙椎间盘突出，有5例为2间隙椎间盘突出，无3间隙椎间盘突出导致BSS的报道。受累节段最多见于C5/6(53.8%)，其余次依次为C3/4(17.9%)，C4/5(17.9%)，C6/7(17.9%)和C2/3(5.1%)[10]。 颈椎间盘突出以硬膜外型突出最多见，硬膜内疝入共有10例（29%）报道。本组8例从术前MRI上观察均为硬膜外型突出，术中均证实这些游离的髓核穿破后纵韧带，但无硬膜内疝入。硬膜外型BSS病史为1~18月，而硬膜内型BSS则为1天~2月。因髓核疝入硬膜内直接压迫损伤脊髓，故文献报道该型BSS较硬膜外型BSS的临床疗效差[1,3]。所有颈椎间盘突出从MRI横断面上观察均为旁中央型突出，中央型突出则不产生BSS症状。因突出的颈椎间盘主要压迫脊髓而非神经根，故仅有9例患者表现为根性疼痛症状。此外，临床上软性颈椎间盘突出并不能使脊髓半侧功能完全丧失，故其临床不表现为典型的BSS：1）通常突出侧的皮质脊髓侧束和脊髓丘脑束受累，而后索不受累不明显，故临床病例无一出现位置觉及振动觉的完全丧失。2）皮质脊髓侧束受压但功能不是完全丧失，本组8例脊髓压迫侧肢体的肌力为2~4级不等，无完全半切时损伤侧肌力0级的表现。3）因所有病例临床表现并非典型BSS，故早期在行颈椎MRI检查之前易误诊为脊髓炎、多发性硬化及亚急性联合病变等神经内科疾患，而丧失最佳治疗时机。颈椎间盘突出导致脊髓半侧严重受压，脊髓功能明显受损，故在诊断明确后均需采取早期手术减压治疗，以最大程度恢复脊髓功能。虽然有颈椎间盘突出通过保守治疗而自然吸收的报道，但Shimomura等[11]通过对56例非手术治疗的脊髓型颈椎病患者进行回顾性调查研究表明，对于轻度（术前JOA评分13～17分）脊髓型颈椎病患者通过保守治疗可以获得良好的临床疗效，而对于存在MRI轴向面上脊髓有环状受压、硬膜下腔消失的轻度患者则需手术治疗。本组8患者术前JOA评分为10分以下，故不适宜采用保守治疗，手术治疗为首选。同样，多数文献支持BSS早期手术减压治疗以挽救脊髓功能，甚至部分外伤引起的BSS需急诊手术治疗。因BSS髓核自前方压迫脊髓，故前入路手术减压可直接摘除致压物，减压彻底。早期部分学者采用后路椎板成型间接减压手术治疗[12]，但多数学者认为，后路间接减压无法摘除压迫物，此外颈神经根及齿状韧带对脊髓的“锚固效应”使得脊髓后移程度有限，影响后路手术临床疗效。 Lee等[2]则采用前路椎间孔切开术，于钩椎关节内侧钻孔（5×8mm大小），显微镜下微创切除突出的髓核。因其技术要求较高，术式难以推广普及。多数文献报道采用前路经椎间隙减压（61.5%）或椎体次全切除减压植骨融合内固定术（10.2%）治疗BSS。通常，这两种手术方式的选择上应遵循以下的原则：1）如为单间隙突出，椎管发育良好，骨赘增生不明显，可行单间隙减压融合固定以保留颈椎运动节段；2）对于两个间隙以上的椎间盘突出，颈椎退变骨赘增生明显，且髓核较大突破后纵韧带而游离于后纵韧带至椎体后方，或疝入硬膜囊内，经椎间隙因术野有限难以完整摘除脱出髓核者可采用椎体次全切除减压融合内固定术。总体上，通过手术减压后患者均有较为满意的临床恢复，少数残留部分运动和感觉障碍。文献报道在29名硬膜外突出患者中有16名（55%）获得完全恢复，而10名硬膜内突出患者中有3名患者（30%）获得完全恢复[1]。总之，颈椎间盘突出导致BSS临床相对少见，且患者临床表现并不十分典型，故对此类患者宜早期颈椎MRI检查并和相关神经内科疾患相鉴别，早期明确诊断后行前路髓核摘除减压内固定手术，彻底减压是手术治疗成功的关键。

胸腰椎相邻两节段椎体爆裂骨折和脱位多为巨大暴力致伤，损伤机制复杂，且多属不稳定性骨折并伴有脊髓损伤，故多需早期外科手术治疗[1,2]。因其与单一胸腰椎椎体骨折损伤力学机制不同，采用单纯的跨越伤椎的上下正常椎体椎弓根螺钉内固定常导致内固定手术失败，而延长固定节段虽能提供足够的脊柱稳定性，但牺牲了多个正常的脊柱运动单元，因此该类骨折临床治疗较为棘手。1相邻两节段胸腰椎骨折的临床特点相邻两节段胸腰椎骨折较单一胸腰椎骨折少见，多为较大暴力导致，致伤机制复杂，合并伤多，有着与单一骨折不同的临床特点：1）Calneff等[4]提出多发脊柱骨折的原发和继发损伤理论：暴力直接造成的第一处骨折为原发骨折，暴力传导造成相邻或间隔的骨折为继发骨折。通常原发骨折损伤较重，继发骨折损伤较轻。脊柱的胸腰段为脊柱生物力学的“拐点”，暴力在此处会产生不同方向的剪切力，因此该处常成为高空坠落伤的脊柱原发骨折部位和关键损伤点。本组34例患者中，T11~L2部位骨折占27例（79%），且高空坠落伤19例（56%），符合文献报道。2）部分A1类型继发损伤椎体在X线片上容易漏诊，需要CT或MRI确诊。随着对脊柱多节段骨折的认识不断加深，以及临床CT和MRI检查的普及，其漏诊率越来越低。3）致伤暴力较大，合并其它脏器损伤概率增加。2 相邻两节段脊柱骨折的手术及非手术治疗方案的选择胸腰椎爆裂骨折使得椎体骨质损伤严重，手术目的在于解除椎管内压迫、矫正脊柱畸形、恢复椎体高度及稳定脊柱[5]。目前常用的后路椎弓根螺钉内固定具有术式简单、损伤小等优点而被认为是治疗该类骨折的金标准[6]。目前对于相邻两节段胸腰椎骨折的治疗仍存在一定争论，但多数学者认为多节段脊柱骨折的手术适应证应较单发性脊柱骨折适当放宽[7]，对于不稳定型脊柱骨折或伴有脊髓神经功能受损的病例,手术治疗的疗效优于非手术治疗。因相邻连续两节段胸腰椎骨折为多平面骨折，应力分散，脊柱稳定性丧失，前路手术虽然能直接取出压迫脊髓的碎骨块，但较难进行有效的内固定，且手术创伤大，失血多。后路椎弓根螺钉内固定技术与解剖简单、创伤小、操作简单，尤其适用于多发伤的患者。但是，后路椎弓根内固定在固定及融合节段的选择上，目前尚无定论。既往的跨越伤椎后路长节段椎弓根内固定治疗连续两节段胸腰椎骨折可坚强地稳定脊柱，但却牺牲了脊柱运动节段，导致术后脊柱僵硬、疼痛以及临近节段严重退变等诸多并发症的发生[8]。3后路4椎4钉、4椎6钉和4椎8钉内固定的生物力学特点胸腰椎单椎体骨折的后路3椎4钉短节段椎弓根螺钉复位内固定是治疗胸腰椎骨折的金标准，但随着临床应用的增多，出现了较多的内固定失败和畸形矫正丢失的现象。生物力学研究分析表明，椎弓根螺钉内固定后，作用在螺钉上的主要力量是悬臂曲力（悬挂效应），而在椎体爆裂骨折导致前中柱损伤未能重建时，这种悬臂曲力负荷更大，因此容易导致断钉和断棒。加之3椎4钉的平行四边形效应，更加促进了内固定的失效[9]。有学者提出应用3椎6钉法内固定，即将螺钉拧入骨折椎和其上下紧邻的椎弓根及椎体内, 通过在骨折椎上建立一个支点,纵行撑开骨折椎与其下位相邻椎获得韧带轴向复位[9]。经伤椎内固定方式显著增加了脊柱的强度、刚度及稳定性, 既能更好地分散内固定的承载应力, 又能减少内固定的松动或断裂， 有效地降低了内固定的悬挂效应和四边形效应， 故能降低迟发性脊柱后凸畸形的发生率。有学者通过延长内固定节段（伤椎上下各固定2个正常椎体）来获取脊柱的稳定，但丧失了更多的脊柱运动节段，导致不良后果[8]。通过在次要伤椎上置钉，建立了一个支点，有效地增加了脊柱的强度，并分散了内固定的承载应力，而同时次要伤椎上的支点有利于关键损伤椎的撑开复位，较4椎4钉法关键损伤椎的复位和畸形矫正效果明显。我们的随访发现，虽然没有内固定断裂和松动，但关键伤椎的后凸畸形矫正度数有一定程度的丢失。而临床上胸腰椎骨折CT扫描发现伤椎椎弓根骨折很少出现，而在椎弓根与椎体后缘结合部是骨折好发部位，且椎体骨折多出现在椎体前上部，而椎体中下部多完整，可见经伤椎椎弓根固定在理论上是可行的。4关键损伤椎置钉的要点1）关键伤椎置钉前需要通过CT确定椎弓根损伤的程度，如椎弓根损伤严重且移位则不适合置钉。置钉前我们强调过伸体位复位，使得伤椎高度和形态有一定程度的恢复，为伤椎置钉提供较大的可操作空间。2）椎弓根螺钉进钉点选择上较常规入钉点偏外，以免进入椎管。其次需选择较其他椎体上的螺钉短2个螺纹的螺钉， 螺钉指向伤椎前下角方向进入以免影响伤椎椎体愈合，同时避免因螺钉过长增加螺钉的把持力影响复位效果。这点和王守国等[10]报道的尽量贴近上终板进钉方法有所不同。3）伤椎椎弓根螺钉不需完全拧入伤椎，预留2圈螺纹，将预弯连接棒的弧形前凸点对准伤椎椎弓根螺钉尾帽开口并拧紧固定，将伤椎前顶，然后以关键损伤椎椎弓根螺钉为支点，行关键损伤椎—正常椎体和关键损伤椎—次要损伤椎之间的器械复位内固定（建立了复位的新支点）。通过对伤椎进行顶推并压缩后柱的方法，不仅复位直接，更可达到延长前柱，缩短后柱的目的，更符合脊柱的生物力学机制。

长期以来，对于日常生活中极为常见的锁骨骨折更多地采用非手术治疗。虽然非手术治疗具有创伤小，操作简单等优点，但患者遭受痛苦大，病程长，而且复位不确切、容易再移位，且长期固定对肩关节功能影响很大。随着现代交通和制造业的飞速发展，车祸伤等高能量创伤常导致架于胸廓前上方呈“~”形弯曲锁骨向前凸和向后凸这两个曲度交接处的粉碎、严重移位骨折。此类骨折处软组织损伤严重，骨膜多自行剥离，碎骨块多且丧失血供并嵌插入软组织中[6]。最近，加拿大8个医疗中心针对132例锁骨中段完全移位骨折病例进行了一项多中心临床随机对照研究[7]，对进行手术钢板内固定和保守治疗的两组患者的肩关节评分、X线片检查、患者满意度、肩关节活动范围和外观以及并发症方面的数据进行比较, 结果表明在1年随访终点时，手术治疗组患者在肩关节功能、骨不连和骨不愈合等不良发生率上，均优于非手术治疗。而Robinson则提出一种新的分类方法，用来预测锁骨骨折延迟愈合、不愈合的风险[3]。他将锁骨骨折分成内、中、外三段，而多发的中段骨折又分为2个亚型：2A型骨折均有残留的骨接触；2B亚型主折段之间无残留的骨接触，均有明显的不同程度骨短缩，其又分为2个亚型：单纯或楔形粉碎性骨折（2B1）和孤立的或粉碎性节段性骨折（2B2）。Robinson对1000例采取保守治疗的锁骨骨折患者进行随访[3]， 发现2B型骨折中有3.2%发生延迟愈合、5.8%发生骨折不愈合，其随访结果显示保守治疗不良结果远远高于以往的文献报道。因此，基于上述认识，目前临床医师对于不稳定的复杂锁骨中段骨折多采用手术复位内固定治疗[1-4]。本组32例患者均位2B1和2B2型锁骨骨折，术中切开复位时均能探察到骨折端有大小程度不等的碎骨块，部分骨膜完全剥离而呈游离状，部分插入邻近肌肉中，部分碎小骨块无法精确复位。本组32例采用手术切开复位重建钢板内固定治疗达到了准确复位、牢靠内固定、无不良并发症的预期目的，优良率达到94%。随着对锁骨生物力学及临床研究的深入，研究者发现在锁骨中段骨折时，锁骨受力非常复杂，肌肉和韧带的牵拉力以及肢所产生的重力都对骨折移位产生影响。因此，手术内固定治疗锁骨骨折需要达到恢复骨骼的正常解剖形态以便恢复锁骨生物力学动态平衡的最终目的[8]。因此，内固定物固定锁骨后，其强度和所受的应力是关系到手术治疗效果的两个主要因素。克氏针或克氏针钢丝张力带内固定是传统的锁骨骨折切开复位内固定方式, 其手术创伤小, 取针容易。 但克氏针固定很难在每一受力和运动平面上达到良好固定, 不能很好地对抗旋转和轴向应力，骨折端容易产生剪切不稳定的应力，故术后的早期肩关节功能锻炼受影响。其次,可能出现克氏针的松动、退针、感染等不良并发症[1]。 普通钢板较厚难以塑性和不规则的锁骨紧密接触, 长期处于应力状态, 容易因应力集中而造成钢板断裂或螺钉松动, 造成骨折畸形愈合或不愈合[9]。而形态记忆合金环抱钢板内固定存在者环抱器固定对骨膜的血液供应干扰较大, 且和锁骨接触不均一、安装及取出操作繁琐等缺点。重建钢板较薄, 有一定弹性, 可根据锁骨的外形进行适当的塑形而贴服于锁骨上。当锁骨的主骨折线为上下走行时，钢板应放置在锁骨上方张力侧；而主骨折线为前后走行时，钢板应放置在锁骨前方的张力侧[4]。如此紧贴骨面放置的钢板可在锁骨上起起到张力带固定效应, 有效对抗弯曲应力、轴向应力及旋转应力，可有效避免在外力作用下张力侧分离, 有利于骨折端应力侧加压, 特别适合于锁骨中段粉碎性骨折[10]。骨折端牢固固定后能早期进行肩关节功能锻炼, 减少了因骨折对位不良所导致的各种并发症的发生。因此，笔者认为重建钢板治疗锁骨中段粉碎性移位骨折值得推荐。本组32例患者治疗后疗效满意也佐证了这点。笔者认为本组32例患者手术内固定取得了良好临床疗效与注重下列技术要点密不可分：1）锁骨中段Robinson2B型骨折常导致局部软组织严重损伤，骨块碎裂为多个大小不等的碎骨块，甚至部分骨膜完全剥离而丧失血供。因此，在手术剥离和骨折复位时必须注意保护骨折端和碎骨块的血供，遵循骨膜外剥离的原则，并注意保留附着于骨块上的肌肉软组织，不能强求骨折完美复位而剥离碎骨块上软组织和骨膜而使骨块完全游离丧失血供。较大的碎骨块可用螺钉和骨折端骨干固定，无法用螺钉固定的骨折块可钻孔后用可吸收丝线固定于骨干上。注意避免用钢丝固定，从而进一步影响血供导致骨折不愈合。此外， 提高钻孔技术，不主张为安全起见而完全剥离骨下方的骨膜以放入金属阻挡器。 2）锁骨中段Robinson2B型骨折是复杂不稳定型骨折，骨折端有较大的应力和剪切力。选择长度合适的重建钢板以保证骨折线两侧有3个或3个以上的固定螺丝而消除骨折端的应力和剪切力，同时螺钉必须双皮质固定以防止螺丝钉拔出。本组1例患者因术中护理配合的原因导致紧邻骨折端的2枚螺钉较短而未穿过对侧皮质，随访期间发现螺钉轻度拔出，骨折端有向上10°的成角愈合。 3)熟悉锁骨的解剖结构，直视下复位骨折后，尽量将重建钢板一次性塑型成功，避免反复塑型和锐性折弯而降低钢板的强度，以减少钢板断裂的可能。重建钢板只有根据锁骨骨折的主骨折线的走行而放置在锁骨的上方或前方的张力侧，才能有效地起到张力带固定效果。4）骨折切开复位后，应将所有骨折断端碎小骨折块都回植到骨折部位。本组32例锁骨中段Robinson2B型骨折复位后无一例骨缺损，故术中未行植骨，术后骨愈合良好。但作者同意文献报道所述，如术中骨折复位后遗留骨折端骨缺损，应术中一期植骨，以避免骨折不愈合[6]。5）术后肩关节功能锻炼的时间和强度应循序渐进，在随访指导下进行，骨折愈合前避免肩关节过度外展，禁负重。本组32例锁骨中段Robinson2B型骨折的手术治疗临床疗效满意，说明手术能有效地恢复属于肩关节内骨折的粉碎性锁骨骨折的解剖形态，辅助坚强的重建钢板内固定后为骨折愈合创造了条件，并能使肩关节术后早日进行功能锻炼。

富血小板血浆( plate let rich plasma, PRP) 是自体全血经过梯度离心、分离得到的血小板浓缩物, 血小板含量丰富。当血小板激活时, 能释放多种生长因子,它们在促进骨细胞和成骨细胞的增殖、生长、分化和组织的形成过程中起着重要的作用[1]。自1998年Marx等[2]首次用PRP复合移植骨修复下颌骨缺损以来，PRP已逐渐应用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神经外科等领域的组织修复中。本文现就PRP的分离、制备和其在骨科领域的应用以及存在问题进行综述, 并对其应用前景作一展望。1 PRP的分离和制备PRP是根据血液中各组成成分沉降系数不同，通过密度梯度离心法将PRP从全血中分离出来的PLT浓缩物，但目前尚无统一的制备方法[3]。 不同离心次数、离心力、离心时间以及PLT不同的激活方式所制备的PRP中，PLT数量、各种生长因子浓度、白细胞数量各不相同[4]；且各种手术方式以及应用PRP的时间亦产生不同的生物效应，因此产生了对PRP生物效应的分歧[5]。根据不同生理病理需要，制备不同生长因子含量的PRP是未来研究的方向。 PRP的制备方法大体可分为手工制备和全自动制备两种。手工制备过程较繁琐，但所需设备简单，易于开展。全自动制备需要特殊设备，目前常用设备有SmartPReP 系统、Trissee 系统、Platele concentrate collection系统、Curasau 系统等。手工操作分离法与全自动血小板分离机分离法在离心后，血小板数量无明显差异，虽然全自动血小板分离机操作简便，自动化程度高，制备得到的PRP血小板纯度和浓度均高，但此方法一般用于用血量较多(一般在150ml以上)或需建立静脉循环通道，目前主要用于血库血小板的采集以进行成分输血，因其成本较高，限制了其在临床的广泛应用。但无论是何种制作方法，其制备原理均相似，即根据血液中各组分的沉降系数进行分层制备。1次离心后血液可分为3 层，最底层是沉降系数最大的红细胞，最上层是上清液，交界处有一薄层，即富血小板层。一次离心后弃去上清液或红细胞层，然后改变离心力再次离心，可分离更多血小板。两次离心法仍是目前制备PRP的常用方法。刘彩霞等[6]比较了动物模型中不同离心力和离心时间所制备的PRP对牵张成骨的影响，结果显示应用Landesberg法以两次离心（每次200 × g、离心10 min）法制作的PRP血小板计数明显高于全血，为全血的6.17 倍；血小板回收率超过86%，促进新骨生成的作用较明显。离心力> 250 × g时会导致血小板破坏过多，而一次离心时间< 5 min得到的PRP血小板浓度与全血无明显差异[7]。Marx[2]等在制作PRP时发现，先进行高速离心，1次离心后界面以下2mm的红细胞层血小板浓度最高，弃去上清液后再次以低速离心，这样可更好地提取血小板。但多数学者研究认为，采用改良Appel[8]法，即先以低速离心后吸取全部上清液、交界层下少部分红细胞置于另一支离心管，然后高速离心，所得的血小板回收率较高。 2富血小板血浆的作用机理 PRP的作用是通过生长因子的相互作用和相互调节下完成的, 生长因子分泌后立即黏附至靶细胞膜表面，激活细胞膜受体。这些膜受体再诱导出内在的信号蛋白，激发细胞正常的基因序列表达。因此，PRP释放的生长因子不进入靶细胞内，不会导致靶细胞的遗传性能发生改变，仅使正常愈合过程加快。虽所有参与组织修复与重建的细胞因子作用机制仍不明确[3]，但是细胞因子对组织修复与重建的部分作用已经明确，如：PDGF是最早出现在骨折部位的生长因子之一, 可以刺激骨髓基质细胞的有丝分裂,增加成骨细胞的数量; 刺激内皮细胞的生长, 促进受植区的毛细血管的生成; 还可以刺激单核巨噬细胞的趋化。作为一种促进有丝分裂和生物趋化因子, 可以在创伤骨组织中高度表达, 促进成骨细胞的趋化、增殖, 并增加胶原蛋白合成的能力[ 9] ；TGF-β以旁分泌和/或自分泌的方式作用于成纤维细胞、骨髓干细胞、成骨前体细胞和破骨细胞, 刺激成骨前体细胞及成骨细胞的趋化、有丝分裂及胶原纤维的合成, 抑制破骨细胞的形成和骨吸收, 在骨折修复中具有极为重要的作用[ 10] ；IGF促进成骨细胞的增生和迁移作用, 提高成骨细胞活力 ; VEGF可诱导内皮细胞增殖迁移从而促进新生血管形成等[11]。另外，激活的PLT同时释放大量蛋白质，这些蛋白质对组织再生均有重要意义。凝血酶可以募集周围组织血管内皮细胞，增强其活力，人体脐静脉三维培养条件下，凝血酶可刺激成纤维细胞增殖及新生毛细血管形成，同时可诱导负反馈，从而限制新生毛细血管合成[12]。纤维蛋白刺激角化细胞迁移，实现细胞和细胞间的相互作用，对细胞形态恢复具有重要意义[13]。3 PRP 在骨科领域的应用3.1 骨缺损修复骨缺损的修复一直是骨科临床所面临的难点之一, 目前对骨缺损修复的方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植、生物材料填充、组织工程技术、基因治疗等。自体骨移植时虽可以取得满意的疗效,但骨来源有限, 且取骨不仅需要额外的手术操作,还增加患者痛苦, 同时还会引起多种术后并发症及附加损伤。组织工程学的创立和发展为骨缺损的修复提供了新的思路和方法。复合成骨细胞和/或生长因子的生物材料具有良好的骨诱导性，在修复骨缺损中具有良好的应用前景。但是生长因子大多于体外制备，且多为单一因子，制备复杂，价格昂贵。Assoian [ 14] 首先发现了血浆中提取的PRP中含有多种生长因子, 为骨缺损的修复提供了广泛的应用前景。Marx[ 2 ]最早应用PRP进行骨缺损修复的临床研究，其研究结果表明, PRP复合移植骨修复速度比单用移植骨修复速度快1.162倍至2.116倍, PRP组移植骨密度(74.0%±11%)明显高于对照组(55.1%±8%)。Fu jimori等[ 15]将自体骨复合PRP用于兔胫骨缺损, 研究发现PRP不仅加快新骨形成, 同时提高新生骨质量。Kovacs等[16] 在犬下颌骨缺损修复研究中发现通过骨密度评价和组织学评价, 复合PRP的生物材料组均优于单纯使用生物材料组, 认为PRP对骨缺损有修复作用。3.2 脊柱融合方面的应用PRP的研究为脊柱融合开辟了一条新途径, 它解决了自体骨来源有限, 异体骨免疫排斥反应, 生物材料无骨诱导活性, 单一生长因子制作复杂、价格昂贵等缺陷, 明显促进成骨作用, 加速骨愈合能力, 提高脊柱融合率, 促进患者术后病情恢复及生活质量的提高。但目前PRP在脊柱融合方面尚处于研究阶段, 相关报道有限。Lowery等[ 17]证实PRP能够早期促进骨融合, 在临床上应用于腰椎融合时产生良好的效果。Hee 等[18] 报道，自体髂骨复合生长因子早期骨融合率高于单纯自体髂骨植骨，23例应用自体髂骨复合PRP 患者中，术后4 个月及6 个月X 线评价融合率为70% 及96%，而自体髂骨移植患者中分别为36% 及94%，术后24 个月，两组间无明显差异，分别为96% 和94%。Castro 等[19]在腰椎间孔入路腰椎椎间植骨融合术研究中发现，复合PRP组融合率低于对照组19%，分析原因可能与腰椎生物力学环境、制备PRP的技术、PLT数量、功能以及生长因子浓度有关。3.3 半月板关节软骨损伤与修复通常，受损的关节软骨本身只有很弱的再生修复能力[20]，如何对受损的关节软骨进行修复、恢复关节面完整性、重建关节功能和防止关节退变是再生医学的研究热点。动物实验及临床应用均表明PRP 具有促进损伤软骨组织修复的功能。Cugat 等[21]在兔全层软骨损伤模型中，首次应用局部注射自体PRP，发现软骨的生物力学行为明显改善，软骨细胞增殖，软骨损伤明显修复。Kon等[22]最近报道关节内注射PRP治疗100例患有慢性膝关节软骨退行性疾病患者(每次注射PRP 5ml，21天注射3次为一疗程)，注射后注射口无菌包扎并嘱患者屈伸膝关节数次，术前和术后应用患者自评总体健康状况视觉类比量表(EQ-VAS)和国际膝关节评分委员会(IKDC )主观和客观评估表进行临床评分，结果显示治疗2个月、6个月和12个月后临床各项评分均较术前显著提高。Everts 等[23] 在单侧全膝关节置换手术后应用PRP，随访5个月，发现应用PRP后关节纤维化程度较对照组明显减轻，关节活动范围明显好。Mitsuyama 等[24] 研究了PRP对人类软骨细胞的作用，10 位参与试验的志愿者分别提供全血和膝关节软骨组织，用于制作PRP和提取软骨细胞，将提取出的软骨细胞分别以不同浓度的PRP处理，观测其增殖情况。10 天后观测结果显示，30% 的PRP能显著促进人软骨细胞的增殖，细胞增殖不仅受PRP影响，而且与PRP浓度的增加成正相关。如上所述，PRP可以作为修复软骨时的一种治疗选择3.4 修复韧带/ 肌腱损伤肌腱组织由腱细胞、纤维胶原蛋白和水分构成，自身缺乏血液供应，故受损后的愈合速度慢于其他结缔组织。随着研究深入，学者们发现生长因子在韧带修复过程中起到至关重要的作用，进而尝试利用PRP来促进或辅助治疗肌腱损伤。Anitua 等[25]将PRP与人肌腱细胞共培养后发现，随着肌腱细胞的增殖，培养基中VEGF及肝细胞生长因子（HGF）也相应增加，而VEGF具有促进血管形成的作用，HGF具有抗纤维化作用，减少瘢痕形成。临床应用PRP治疗韧带/ 肌腱损伤取得满意疗效。Sánchez等[26]收治12例跟腱撕裂患者，其中6 例作为试验组在手术同时进行PRP 辅助治疗，6 例作为对照组只进行手术治疗。结果显示试验组患者恢复活动范围较对照组早，且未发生相关并发症，Mishra等[27]应用超声引导使用PRP治疗慢性肘部肌腱疾病取得满意疗效。140例患者均首先给予理疗及其他非手术治疗，20例患者疼痛无好转，其中15 例经皮下注射PRP，对照组5 例注射布比卡因，随访皮下注射PRP 患者中，8 周后60% 患者疼痛缓解，6 个月后81% 患者疼痛缓解，25.6 个月后93% 疼痛缓解并且能在更短时间内恢复训练活动3.5 预防骨与关节感染骨与关节感染是骨科手术面临的难题之一，常用预防方法是在围手术期应用抗生素[28]。但长期大量应用抗生素不仅带来各种系统副作用，还会导致耐药菌株的出现[29]。因此，有必要探索一种新的解决骨感染问题的方法。PRP由于其含有的高浓度血小板可以释放大量生长因子，当PRP被凝血酶激活后形成血小板-白细胞凝胶（PLG），其中含有高浓度的血小板和白细胞，这些细胞成分在机体先天免疫防御反应中发挥着趋化、吞噬和氧化杀菌等重要作用[30] 。此外，血小板还可释放大量生长因子促进被炎症破坏的组织细胞再生，为炎症消退提供良好的局部微环境。PRP的这种多重特性使其具有传统抗生素所不具备的优势。因此，作为一种“生物抗菌制剂”，PRP为我们预防和治疗骨感染提供了一种新的思路。Bielecki 等[31] 通过纸片扩散法研究发现，PLG在体外可以抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。Moojen 等[32] 也报道了PLG在体外具有抑制金黄色葡萄球菌生长的作用。此外，一些临床研究表明PLG可降低外科手术后的出血和感染发生率[33-34]。PLG在体外不仅可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，而且在体内局部应用还可以抑制细菌生长，还可以协同机体免疫防御系统杀灭细菌，从而预防骨与关节感染的发生。4 展望采用生物的方法解决生物和医学问题是目前研究组织修复的热点。PRP完全是自体的, 无疾病传染及免疫排斥反应, 从根本上解决了传播疾病的危险及骨组织工程学一直面临的移植物难以存活的难题; PRP中含有多种高浓度的生长因子, 各生长因子的比例与体内正常比例相似, 并具有最佳的协同作用, 既有单一因子的生物学效应, 又有各种生长因子之间的相互作用。这在一定程度上弥补了单一生长因子刺激成骨效果不佳的缺点, 满足了早期骨愈合所需生长因子的需要; PRP有促凝血的作用, 可刺激软组织再生, 促进伤口早期愈合; PRP中所含的生长因子不进入细胞内或细胞核内,使正常的愈合过程加速, 无致畸作用, 也不具有诱导肿瘤形成的能力; PRP制作简单且对患者的损伤小, 只需从患者的静脉取血即可制作PRP, 国外已有专门制作PRP的仪器, 操作简便并且所需时间短。因此, PRP是一种安全的、简便的、廉价的可用于骨科的各个治疗领域，应用前景广泛。但PRP用于临床尤其是在骨科领域仍有许多尚未解决的问题，如PRP制备无统一标准，不同方法制备的PRP生长因子浓度差异大，PRP所含生长因子数量及其生长因子的相互作用机制仍不明确等。因此对PRP研究首先要建立一套高效稳定、对PLT破坏小、纯度高而稳定的PRP制备方法; 其次在应用PRP时尽量避免影响PRP疗效的因素; 选择适当的载体使PRP 与载体结合以提高PRP骨再生能力, 建立动物模型, 设计标准化的试验, 为PRP的临床应用提供依据。

脊柱先天性畸形、退变、获得性不稳以及脊柱肿瘤等疾患治疗后脊柱稳定性的重建都需要通过骨移植来促进脊柱融合。美国临床统计数据表明每年超过25万例的脊柱融合手术多数需要骨移植来促进脊柱融合，中国虽然没有确切的统计数据，但就人口比例来说，实际情况可能超过美国。虽然自体骨移植仍然是促进脊柱融合的金标准，但仍然有5-35%的单节段脊柱融合患者发生骨不融合，而多节段脊柱融合的骨不连发生率则更高[1]。此外，自体骨、异体骨以及生物替代材料移植仍存在诸多难以解决的问题。因此，临床亟需进一步研究骨再生的生物学机制以寻求更好的促进脊柱融合的方法[2]。应用局部基因治疗技术可在脊柱特定的解剖区域释放成骨递质以刺激新骨的形成从而最大程度地促进脊柱融合，该方法是一种较有希望替代传统自体骨移植的新型治疗技术。本文拟就近年来基因治疗促进脊柱融合的相关研究进展做一综述。基因治疗促进脊柱融合研究的应用前景脊柱融合不同于四肢长骨骨折的骨愈合：1）不是重建原有的解剖结构，而是通过重建合理的脊柱机械力学结构来改变因脊柱侧弯、滑脱、肿瘤、感染和创伤所致的脊柱病理解剖变化。2）脊柱后外侧横突间融合具有独特的局部微环境：横突细小，去皮质后对移植物的血液供应小，特别是移植物的中央部位，需要血管再化生；横突间融合是在椎体旁肌肉间的大段异位成骨，其融合的机制和所受的力学环境不同于四肢骨移植的正位骨修复[3]。近年来，涉及生命科学和工程学的骨组织工程学技术已成为骨修复重建领域的重要研究热点。在脊柱融合的临床实验研究中，需要在后外侧横突间植入高达毫克级的重组人骨形态发生蛋白（rhBMPs）才能有效地促进脊柱融合以克服外源蛋白应用易流失、半衰期短和效率低等缺点。但是，超生理剂量的rhBMPs临床应用存在费用昂贵、长期生理影响不确定等缺点而难以在临床进一步应用。目前，在基因治疗研究策略已经调整为重点治疗非致死性疾病的背景下，利用现有技术，基因治疗最有希望在骨科领域的临床组织修复（如骨愈合等）上取得成功[4、5]。就具有挑战性的临床脊柱融合而言，基因治疗适合用于脊柱融合的治疗[3]：（1）骨愈合过程高度保守，目前对此研究较为深入，而BMP作为一种有效的成骨基因其疗效得以肯定。（2）不同于慢性疾病的治疗，骨愈合通常在几周内完成，此过程并不需要外源基因长期、高效表达。通过选择特定的基因导入载体可控制治疗基因的表达，从而避免过多的新骨生成以影响机体功能。（3）通过局部基因治疗方法，可选择特定的种子细胞，并通过这些基因修饰的细胞将治疗基因导入四肢骨折或脊柱的特定解剖部位，从而可避免全身应用的并发症，其技术要求相对简单。（4）前期动物实验结果较为满意。基因治疗促进脊柱融合的策略和方法2．1 腺病毒介导的BMPs基因治疗促进脊柱融合基因导入系统是基因治疗的核心技术，可分为病毒类和非病毒类载体系统，其中，腺病毒载体因具有高效转染、易于应用并能产生高水平的基因表达产物等诸多优点而在实验和临床前期研究中得到充分应用。Riew等[6、7]利用重组BMP2的腺病毒（AdBMP2）体外转染兔自体骨髓间充质干细胞（BMSC），随后将细胞和胶原载体复合后植入兔L5-6后外侧横突间，结果发现5只实验动物中只有1只产生脊柱融合。该研究小组随后将AdBMP2体外转染BMSC的时间由原来的1天提高到7天，发现所有实验动物都获得了满意的脊柱融合效果。Riew等[8]在此基础上进一步利用AdBMP2体外转染猪BMSC后，通过微创胸腔镜技术将BMP2基因修饰的猪自体BMSC细胞植入胸椎间盘中，6周后证实实验组6个胸椎体间都获得满意的前路融合效果。 Wang等[9]则比较了BMP2基因修饰的鼠BMSC细胞和自体骨在鼠单节段脊柱后外侧横突间融合的疗效，结果发现通过局部基因治疗方法在横突间产生了大量的近似正常的小粱样骨，而自体骨融合样本的组织学则显示为薄、花边样小粱骨。据此，作者认为基因治疗疗效优于自体骨。Hidaka等[10]利用AdBMP7转染体外扩增培养4周的骨髓细胞并种植到异体骨传导支架上构建人工骨材料，随后将该材料移植到裸鼠脊柱后外侧，术后8周的影像和机械力学资料显示脊柱融合率分别达到70%和80%。但是该研究方案涉及冗长费时的细胞培养程序，并不适合临床应用。Helm[11、12]领导的研究组则尝试更为简便的方法促进脊柱融合：将一定量的AdBMP2或AdBMP9经皮直接注射到裸鼠的腰骶椎旁肌肉中，随后的CT影像学和组织学证实动物获得了满意的脊柱融合。2.2 腺病毒介导的LMP-1矿化蛋白（LMP-1）基因治疗促进脊柱融合的实验研究 BMP类分泌性骨诱导因子在高等动物脊柱融合的实际应用中存在着一些缺陷[3]：1）高达毫克级的超生理剂量BMP蛋白才能有效促进脊柱融合且BMP蛋白在体内难以维持有效的生理浓度；2）BMP作为分泌性骨诱导蛋白只是复杂成骨途径中多因子相互作用环节中的一员，因此单独应用BMP诱导成骨不能完全模拟脊柱融合过程中内在的分子作用机制。3）高剂量BMP体内应用的生理副作用有待进一步的观察。基于此，Boden等[3、13、14]利用差异PCR显示技术，成功地克隆了一种新的细胞内信号分子--LMP-1（矿化蛋白-1，LIM minialize protein），该分子表达于成骨细胞分化前数小时，可诱导转染LMP-1基因的靶细胞内BMP2、4、6、7等多种BMP分子及其它生长因子的表达。因此，作为一种胞内信号分子，仅需要少量细胞表达即可发挥级联放大的成骨效应，提高成骨效率。作者认为LMP-1作为成骨早期细胞内信号分子可以克服BMP类分泌因子的缺陷从而能按生理形式完整模拟骨生成的过程。因LMP-1高效诱导成骨，故在体内应用时不需要基因高效转染和表达。Boden等[3]以脂质体为基因转移载体，发现转染了LMP-1基因的大鼠骨髓细胞和脱钙骨基质复合后所构建的人工骨能有效地促进裸鼠胸、腰脊柱融合。虽然该研究中作为基因转移载体的脂质体在体外的转染效率仅为1%，但实验仍然获得了良好的成骨效果。随后，他们发现重组LMP-1的腺病毒（AdLMP-1）在体外转染成骨前驱细胞时只需要很低的感染复数（MOI=O.25pfu/cell），和其他以腺病毒为基因转移载体的基因治疗相比低几个数量级[3]。在兔脊柱融合研究中，该研究组证实AdLMP-1（MOI=0.25-0.4pfu/cell）体外转染兔骨髓或周围血细胞后种植于脱钙骨基质或胶原-陶瓷复合体后能有效地诱导兔腰椎后外侧横突间的融合[15]。因此这种低剂量腺病毒体外转染的治疗模式可以最大限度地避免转染后移植到体内的细胞被机体免疫系统识别清除，有较强的临床适用性。Boden等[16]进一步探索上述实验成果应用于临床的可行性，考虑到既往感染过腺病毒的人群在接受治疗时体内的腺病毒中和抗体可能会影响AdLMP-1的临床疗效，他们将兔预先注射Ad5型腺病毒后复制预先感染腺病毒的兔动物模型, 4或16周后，在移植自体LMP-1基因修饰的周围血细胞细胞促进兔脊柱融合实验时，通过增加病毒感染剂量或受感染的细胞数目（MOI=10pfu/cell、1×107细胞），以及增加病毒感染的时间（30分钟）来克服机体体液免疫排斥反应，达到了满意的脊柱融合效果。2.3 裸质粒介导的BMP7基因治疗促进脊柱融合的研究为避免病毒类载体体内应用可能产生的毒性、免疫反应等副作用，部分学者尝试应用非病毒基因转移载体促进脊柱融合。Bright等[17]通过经皮穿刺和开放手术方法，将25mg或500mg编码BMP7基因的裸质粒和胶原载体复合物植入SD大鼠L5-6后外侧横突间肌肉中，术后2、4周通过组织学检查发现上述方法能成功地诱导肌肉内异位成骨，但没有产生脊柱融合。作者认为可能是所构建的裸质粒和胶原复合物在动物肌肉中所产生的BMP7蛋白总量不足以成功诱导脊柱融合。作者进一步的实验将通过改进裸质粒的结构和优化载体、或者通过肌肉内电转移方法来促进BMP7蛋白的生成，希望能通过这种副作用小的非病毒基因治疗方法能有效促进脊柱融合。2.4 核转染法介导的非病毒BMP6基因治疗促进脊柱融合的研究常规的磷酸钙沉淀、脂质体和电穿孔方法介导的非病毒基因转染的效率较低，且对细胞的毒性较大，难以在临床应用。为克服非病毒基因转染的低效率这一技术瓶颈，德国Amaxa生物技术公司（www.amaxa.com）新近推出的综合电穿孔和脂质体技术的新型非病毒基因转染法—核转染法（nucleofection）。该方法根据不同类型的细胞，通过优化电转移参数和转移液而使靶质粒DNA直接进入细胞核内，从而快速进行转染基因表达。Sheyn等[18]分离培养猪脂肪来源的间充质干细胞后，在体外通过核转染法将BMP6质粒转入细胞中，检测体外外源基因的转染和表达效率。随后作者将这些转基因细胞注射入裸鼠的椎旁肌肉中。研究表明核转染法能有效介导BMP6基因的转染，同时能诱导裸鼠的脊柱融合，且副反应小。2.5 商品化BMPs促进脊柱融合的研究 在多种动物脊柱融合模型中, 应用基因重组技术生产的BMPs取得了满意的融合效果, 为其过渡到临床应用打下基础。Boden等[19]将载有BMP2和可吸收胶原复合物的Cage 通过前入路植入11名患者的腰椎间, 术后2年随访发现所有患者都获得了满意的脊柱融合。临床上，需要高达毫克级商品化BMPs才能有效促进脊柱融合，而高昂的费用限制了其临床应用。3． 基因治疗促进脊柱融合的安全性研究尽管基因治疗促进脊柱融合的动物实验结果较为理想，但是，在临床应用时尚需解决诸多问题，如病毒载体的安全性及治疗基因表达的可控性、种子细胞的优化、支架载体的选择以及多基因联合治疗的问题。而这其中，基因治疗的安全性是首先需要考虑的问题。3.1病毒载体的安全性和治疗基因表达的可控性：通过去除病毒载体所有的病毒基因而只保留其复制和包装所必须的顺式作用元件是病毒载体发展的方向。这种策略可以最大限度地扩大载体的容量和减少病毒蛋白表达所引发的免疫毒性。腺病毒基因组中的早期基因表达产物是导致体内腺病毒应用部位细胞和体液反应的根本原因，这种免疫排斥反应可导致治疗基因表达水平的下降。虽然将基因修饰后的种子细胞注入体内可以避免机体直接接触病毒而产生免疫排斥，但研究表明在某些情况下，感染腺病毒的细胞所表达的腺病毒早期基因产物可能逸漏出细胞而造成免疫排斥反应[20]。因此，生产大部分病毒基因删除的无内脏的腺病毒是腺病毒载体未来应用的一种趋势，其尚未在骨愈合研究领域得以应用。而腺相关病毒（AAV）载体在构建时删除了病毒基因组所有组件而只保留了两端的长末端重复序列，因此该载体体内应用时免疫原性低。 Chen等[21、22]将一定量重组BMP2和BMP4的腺相关病毒（AAVBMP2、AAVBMP4）直接注射到免疫功能正常的大鼠后肢肌肉中，发现能诱导肌肉内异位成骨且注射局部没有免疫炎症反应。 与AAV载体相反，在免疫功能正常的大鼠中，需要在肌肉注射AdBMP2前24小时给予一定剂量的免疫抑制剂以暂时抑制机体的免疫反应才可以观察到有明显的成骨[23]。Chen等[21]推测在免疫功能正常的机体中，利用微创技术将AAVBMP2/4载体多点注射到需要融合节段的脊柱后外侧横突间肌肉中，有望达到满意的脊柱融合效果。治疗基因的高效表达并不是基因治疗时的唯一要求，如果进入体内的基因处于无调控状态将会对机体产生灾难性后果，最佳的方法是能够有序控制基因的时空表达。尽管基因治疗促进脊柱融合的动物实验结果较为理想，对于以干细胞为种子细胞的基因治疗来说，在未来临床应用时，通过严谨调控外源基因的表达时间、持续过程和表达产量而调节治疗基因的表达显得尤为重要，因为骨愈合通常在几周内完成，此过程并不需要BMP等外源基因长期、高效表达。BMP长期、高效表达后过多的新骨生成会造成脊柱融合临近部位的神经根和脊髓不必要的受压；此外，BMP具有多重生理作用，过多的、超过治疗窗口浓度的BMP所引发潜在的全身副作用不容低估。随着安全、无毒、触发式可诱导在转录水平严谨调控基因表达的载体研制成功，为基因治疗进入临床应用提供了有力的工具。新一代四环素调控的基因表达系统（Tet-on/off）有效地解决了诱导物毒性作用、基线逸漏和低水平表达等问题，是最常用的一种基因表达调控系统，适合于未来临床的应用[24]。Gazit[25]等将四环素调控BMP2表达的质粒ptTATop-BMP2（Tet-off）转染C3H10T1/2细胞并筛选稳定表达BMP2的细胞克隆，将细胞和胶原海绵复合后用于修复小鼠的桡骨骨缺损。 实验首次证实四环素衍生物强力霉素(DOX)可调控小鼠体内BMP2的表达并能有效修复桡骨骨缺损。该研究小组新近将2×106个上述细胞直接注射到C3H/HeN鼠的L2-L6椎旁肌肉中，在手术后3、7和30天分别在动物饮水中添加DOX以终止BMP2的表达从而判断脊柱融合所需要的BMP2表达最短时间窗口。结果表明实验组动物4周后即能在脊柱后外侧形成新骨，而8周后可形成更为成熟的板层骨从而达到坚强的脊柱融合[1]。更为重要的是，实验证明在该脊柱融合实验模型中BMP2最短表达时间窗口为7天就足以诱导新骨形成以促进脊柱融合，从而第一次在探讨BMP2时空表达和新骨形成的关系上做出了有益的探索。此外，该实验同时表明在脊柱融合临近部位没有局部以及全身毒副作用。作者推测以可调控的BMP基因修饰的间充质干细胞为种子细胞的基因治疗可能是未来临床促进脊柱融合的有效手段。Gazit等[26]进一步构建了四环素正性调控（Tet-on）的AAVBMP2载体，直接注射到小鼠颅骨缺损处和椎体旁肌肉中亦能有效地修复颅骨缺损和促进脊柱融合。作者将进一步深入研究DOX和新骨生成之间的剂量—骨生成反应曲线，以便最大限度地模拟自然骨生成模式和精确调控骨形成。3.2 商品化BMPs促进脊柱融合的安全性研究临床上, 椎板切除减压后常需要同时行后外侧横突间、前路椎体间或后路椎体间植骨融合。所以, 应用BMPs后如果新骨过多形成, 则有可能导致脊柱融合节段以远部位不必要的融合、硬膜外新骨生成导致脊髓压迫及椎间孔狭窄。 Martin 等[27]将17只恒猴腰椎板切除后应用BMP2行腰椎后外侧融合, 结果发现在椎板切除部位只有反应性骨形成, 而没有过多的新骨生成压迫脊髓。在随后的实验中, Boden 等[28]将BMP2和不同载体复合后植入24只腰椎板切除后的恒猴后外侧横突间, 结果椎板切除后暴露的硬膜上没有骨生成。 已有的研究结果证实BMPs促进脊柱融合是安全有效的。4. 基因治疗促进脊柱融合的动物实验原则。基因治疗促进脊柱融合进入临床实验前必须进行严格规范的动物实验，且动物实验必须遵循从低等到高等动物的原则[13、29]。因动物和人类体内生理和力学解剖环境有所不同，在动物实验中所获得的实验数据推断到人的临床应用中必须谨慎，在动物骨折愈合和脊柱融合实验中获得成功的基因治疗方案不一定在人类临床实验中获得成功。但是，反之，在低等动物实验中不成功的方案必然在更复杂的人体环境中难以取得成功。因此，在低等动物中获得成功的基因治疗促进骨愈合或脊柱融合的方法需要在非人灵长目动物实验中获得成功后方能进入临床实验，最终可以过度到人的临床应用中。目前基因治疗促进脊柱融合的实验研究仍局限于小动物实验研究，且多为单一的脊柱后外侧横突间融合模式，进一步深入研究需以非人灵长目动物为实验对象，进行外侧横突间和椎体间融合实验研究，以求更接近临床实际。5.结束语大量临床前期研究数据清楚表明局部基因治疗技术可应用于人类疾病治疗，但针对需要接受骨修复治疗的患者而言，自体骨移植仍然是目前临床常规治疗方法。一般而言，基因治疗技术并不是对所有患者来说都是必须的。但是，对于难治性骨修复而言，该技术提供了一种新的治疗途径。此外，当应用基因治疗策略治疗上述疾病时，研究者必须考虑到这些新的分子治疗方法是能够用来改善患者的生活质量，而不是用来治疗致死性的疾病。因此，首先要考虑这种治疗的安全性。动物实验研究中较理想的腺病毒载体在未来临床应用中必须进一步加以改进以确保其应用时有极大程度的生物安全性。随着安全、高效并能实现治疗基因精确调控的基因治疗技术进一步完善，基因治疗技术有望替代临床常规自体骨移植而成为促进脊柱融合的常规手段。