高明宏医生的科普号

中国实用眼科杂志2010年8月第28卷第8期Chin J Pract Ophthalmol，August 2010，Vol 28，No．8眼表重建手术治疗睑球粘连的临床研究高明宏 徐旭 杜春光 禹海 于静 周润海 王颖论著：临床研究·【摘要】 目的观察根据睑球粘连病变严重程度选择不同眼表重建术式的有效性。方法选择2005年1月至2008年06月在沈阳军区总医院眼科住院睑球粘连患者29例32只眼，根据睑球粘连及眼球运动受限程度分为4度。在切除睑球粘连病变瘢痕组织基础上，联合应用自体或异体角膜缘干细胞移植，应用自体结膜、自体口唇黏膜、羊膜组织等进行结膜囊重建，角膜受累者行板层角膜移植术。分别观察眼表面重建效果、眼球运动、视力、移植物情况及合并症，疗效分为完全成功、部分成功及失败。结果经过超过1年以上时间随访，32只眼中完全成功21只眼(65．63％)，部分成功8只眼(25．00％)，失败3只眼(9．38％)。视力提高者为18只眼(56．25％)，合并症为睑球粘连复发、角膜植片排斥及持续性角膜上皮缺损。结论根据睑球粘连病变严重程度选择不同眼表重建术式可取得较为满意地临床疗效。【关键词】睑球粘连；眼表重建；板层角膜移植；羊膜；口唇黏膜Clinical research for ocular surface reconstruction in patients with sym blepharonGAO Ming-hong,XU u．DU Chun-guang,yUHal,yUJing,ZHOURun-hal,WANG Ying．Department ofOphthalm ology,the GeneralHospital,ShenyangM ilitary Command,Shenyang j10016,China【Abstract] 0bjeetive To investigate the efects ofvafious surgical strategies for ocular surface reconstructionin patients with symblepharon．Methods Twenty—nine patients (32 eyes)with symblepharon visitedGeneral Hospital，Shenyang M ilitary Comm and betw een January 2005 and June 2008 were divided into 4 de—grees depending on the sevefity of symblepharon and restriction of the ocular motility．111e surgical procedureto correct symblepharon involves lysis of cicatrix followed by conjunctival-·limbal autograft／allografl transplan·-tation，plus fomix reconstruction with such a tissue substitute as autologous conjunctiva，autologous oral mu—cosa or amniotic membrane．Lamellar keratoplasty were performed simultaneously in comea invoked cases．Efects of ocular surface reconstruction，eye movement，visual acuity，development of grafts and complicationswere observed．Success was dened as an outcome of complete success or partial success and failure．ResultsFor a follow-up ofmore than 1 year，the complete Success was achieved in 21 eyes(65．63％)，the partial Successwas achieved in 8 eyes(25％)and failure resulted in 3 eyes(9-37％)．Anatomic improvement was accompaniedby improved visual acuity．The complication include symblepharon recurrence，graft rejection and corneal ep—ithelium defection．Conclusions For the treatment of symblepharon，various surgical strategies for ocular sur—face reconstruction depending on the sevefity can get beRer results．Ⅱ【ey wordsl Symblepharon；Ocular Surface reconstruction；Lamellar keratoplasty；mmniotic mem—bran e；Oral mucosa睑球粘连是一种常见的难治性眼表疾病，多继发于眼部化学伤、手术及免疫性角膜病等，可导致结膜瘢痕形成、角膜新生血管化、角膜混浊、干眼、眼睑闭合不全、眼球运动障碍等，严重影响患者视功能和美观。单一的结膜囊成形或角膜移植等手术方式不能完全达到理想的治疗效果，根据病变累及范围及严重程度综合选择具体的眼表重建术式是治疗的关DOI：10．3760／ema．j．issn．1006—4443．2010．08．018作者单位：110015 沈阳，沈阳军区总医院眼科键。我院自2005年1月至2008年06月间对29例32只眼各种睑球粘连患者在切除睑球粘连瘢痕组织基础上分别应用结膜角膜缘移植、板层角膜移植、口唇黏膜移植、羊膜移植等多种手术方式进行眼表重建，取得了较为满意的临床疗效，现总结分析如下资料和方法1．病例来源：选择2005年1月至2008年06月在沈阳军区总医院眼科住院睑球粘连患者29例32只眼。2．患者情况：各种睑球粘连患者29例32只眼，男20例22只眼，女9例10只眼，年龄13～72岁，平均(36．86 4-11．82)岁。病程6～28月，平均(15．53±6．40)月；术前视力为光感～0．8，光定位及色觉正常，眼压在10～24mmHg(1mmHg=0．133kPa)之间或指测眼压Tn。其中碱烧伤11例l3只眼，酸烧伤6例7只眼，热烧伤6例6只眼，复发性翼状胬肉3例3只眼，先天性眶面裂睑球粘连1例1只眼，结膜类天疱疮1例1只眼，结膜黑色素瘤1例1只眼。其中7例9只眼曾行羊膜覆盖术，4例4只眼曾行睑球粘连分离术，2例2只眼曾行板层角膜移植术。3．睑球粘连程度：根据患者睑球粘连程度、眼球运动受限情况将其为Ⅳ度：(1)I度：单纯上、下穹隆结膜问条带状粘连，眼球活动轻度受限。(2)lI度：单纯上、下穹隆片状睑球粘连，或伴部分角膜粘连(累及角膜缘内≤2mm)。(3)Ⅲ度：一侧穹隆广泛睑球粘连，伴角膜大面积受粘连(累及角膜缘内>2mm)，但未及全角膜，有3个以上眼位存在复视或眼球活动受限。(4)Ⅳ度：一侧穹隆广泛睑球粘连，累及全角膜，或上下穹隆均广泛粘连伴角膜粘连(累及角膜缘内>2 mm)，9个眼位眼球活动均不同程度受限。人选病例中I度4例4只眼，Ⅱ度6例7只眼，Ⅲ 度13例14只眼，Ⅳ 度6例7只眼l1l。4．移植采用的组织或材料：结膜角膜缘组织分别视具体情况取自自体、亲属或尸体眼；部位为带角膜缘干细胞的结膜组织；口唇黏膜取自患者自体口腔下唇的黏膜薄层。羊膜为保存生物羊膜(江西瑞济生物工程技术有限公司提供，使用前复水处理)，角膜材料为异体尸体角膜材料，均来自沈阳军区总医院眼库，新鲜角膜材料为死亡8h以内或保存在Optisol液中10 d以内，保存角膜材料为甘油保存1年以上角膜材料。5．手术方法：由于睑球粘连病变程度及累积范围不同，灵活选择不同种手术方式联合进行眼表重建手术。在切除睑球粘连病变瘢痕组织基础上，联合应用自体或异体角膜缘干细胞移植，应用自体结膜、口唇黏膜、羊膜组织等进行结膜囊重建。对于角膜未累及的I度、Ⅱ度患者，多选择单纯切除睑球粘连结膜瘢痕组织，对于角膜受累明显的Ⅲ度、Ⅳ度患者，选择板层角膜移植术；单眼受累患者尽量选择自体角膜缘结膜移植，以提供角膜缘干细胞，双眼受累者Chin J Pratt Ophthalmol，August 2010，Yol 28，No．8选择异体角膜缘干细胞移植；结膜囊重建尽量采用自体球结膜和(或)羊膜修补，重度睑球粘连者联合口唇黏膜修补。(1)切除睑球粘连病变瘢痕组织：采用2％利多卡因球周麻醉联合结膜下浸润麻醉(1例烧伤患者因全身状态较差选择全身麻醉)，分离及松解睑球粘连使眼球活动自如，暴露需重建的眼表植床，尽量保留正常的结膜组织。在此基础上视具体情况分别选择结膜角膜缘移植、板层角膜移植术、羊膜移植、口唇黏膜移植。(2)结膜角膜缘移植：参照 1的方法，取材组织包括角膜缘内1mm透明角膜组织、角膜缘和角膜缘后一定范围的结膜及imm～2mm巩膜固有层，上皮面朝上，按解剖关系覆于患眼结膜创面，角膜缘侧对角膜缘侧，10—0尼龙线间断缝合固定于巩膜。(3)板层角膜移植：以环钻在正常和病变角膜组织间直线切透1／2～3／4角膜厚度，逐层剖切变性组织和新生血管直至角膜植床透明。取供体眼球根据植床大小及形状制作供体角膜植片，植床充分止血后覆盖植片，10—0尼龙线间断缝合。(4)自体口唇黏膜移植：取下唇黏膜面积大于缺损的20％～30％左右，修剪成薄片对位缝合于睑结膜及穹窿部。(5)羊膜移植：自体结膜组织或联合口唇黏膜移植后仍有缺损者以羊膜补足。单纯自体结膜组织不足者羊膜植片与残留结膜组织缝合，联合口唇黏膜移植者穹窿侧与口唇黏膜缝合，球结膜侧与残留结膜组边缘缝合，尽量固定于浅层巩膜及睑板创面。行穹窿加深缝线形成穹窿，抗生素和地塞米松球结膜下注射。6．术后处理：术后常规绷带加压包扎3—5 d，植片贴附良好后，尽早开放滴眼。用妥布霉素滴眼液、重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼液和羟糖苷眼液，每晚涂氧氟沙星眼膏，待眼表荧光素染色呈阴性后加用典必殊眼液点眼，之后逐渐减量。行板层角膜移植及异体结膜角膜缘移植患者：局部加用醋酸泼尼松龙滴眼液、1％环孢素A滴眼液，同时口服泼尼松1 mg／(kg·d)[21。之后序贯减量，用药期间检测血压、血糖、血中离子水平，同时给予补钙、补钾。行异体角巩膜缘组织者联合应用环孢素口服。术后7d拆除穹窿固定缝线。7．临床观察及疗效评价：手术后随访至少1年。观察指标：眼表面重建效果、视力、移植材料情况及并发症。睑球粘连分离后眼角结膜表面重建效果的评价依据：①完全成功：睑球粘连分开，球结膜、穹隆结膜及睑结膜重建满意，眼球转动恢复正常，角膜新生血管较术前明显减少，角膜透明度改善。②部分成功：穹窿结膜部分缩窄，局部睑球粘连复发，但比术前明显好转，眼球运动轻度受限。③失败：睑球粘连大面积复发，结膜穹隆部非常浅窄甚至消失，粘连组织和角膜相粘，眼球运动明显受限。结 果1．眼表面重建效果：32只眼中完全成功21只眼(65．63％)，部分成功8只ttl~(25．00％)，失败3只眼(9．38％)。手术总有效率为90．62％见表1。3例失败患者分别为：1例先天性眶面裂患者，术前为上下睑球全粘连，眼睑几近闭锁，正常角膜结构辨识不清，术后1月内再次发生重度的睑球粘连，角膜植片混浊，患者拒绝行二次手术。2例均为双眼化学烧伤患者较重眼，行异体板层角膜移植+异体角膜缘移植+口唇黏膜移植+羊膜移植，术后不同时间发生持续性角膜上皮缺损、角膜植片水肿混浊，新生血管形成，反复治疗无效，再度形成睑球粘连。8例部分成功患者4例于术后不同时间行二次眼表重建手术，均获得完全成功；另4例未采取手术治疗。2．移植材料情况：19例行自体结膜角膜缘移植者均与表面贴覆良好，对合整齐，11例行异体结膜膜移植者7例与表面贴覆良好，对合整齐。另4例先后出现角膜缘血管苍白、结膜下出血等角膜缘症状，给激素冲击、免疫抑制剂口服后好转。8例行自体口唇黏膜移植者术后早期均未见脱落和溶解，与角结膜表面贴覆，术后1周内口唇黏膜植片呈灰白色、轻度水肿，逐渐血管化变红润。5例与睑板贴附良好，形成正常穹窿。3例术后不同时间再度发生粘连，不可辨认正常结构。l9例行板层角膜移植者术后半年时角膜植片透明率为68．42％(13／19)，角膜新生血管较前减少。27例行羊膜移植者早期与角结膜表面贴覆，术后1周羊膜明显变薄，逐渐与周围组织愈合或部分脱落。3．视力：术后视力提高者为56．25％(18／32)，术后视力不变者为43．75％(14／32)。最佳矫正视力在0．2或以上的为65．63％(21／32)。具体见表2。4．并发症：7例患者发生持续性角膜上皮缺损，经双眼包盖、局部涂用抗菌药物眼膏、羊膜覆盖术等，有4例患者角膜上皮修复，另1例行部分永久性睑裂缝合术后2个月角膜上皮愈合；2例持续上皮缺损，最后导致植片水肿混浊。反复治疗无效。5例患者发生角膜植片排斥反应，经局部和全身免疫抑制药物治疗，3例眼植片恢复透明；2例眼免疫排斥反应控制后植片仍混浊伴新生血管化，其中1只眼于1年后行二次全LKP，术后随访5个月角膜植片透明。5例患者睑球粘连复发，2例行二次眼表重建手术效果良好，3例拒绝手术。讨 论1．睑球粘连隶属难治性眼表疾病范畴：其病理基础为受损伤的的睑结膜与球结膜、角膜之间异常接触；角膜缘干细胞功能缺陷；成纤维细胞过度增殖；最终导致局部纤维组织增生和瘢痕粘连。该病治疗应立足于包括结膜、角膜和角膜缘在内眼表形态及功能整体修复。在彻底清除病变组织的前提下，有活力的种子—— 角膜缘干细胞和健康的环境— —结膜替代物缺一不可[31。角膜缘干细胞通过增殖、分化、移行为角膜上皮和结膜上皮，获得角结膜表面的重建。可通过自体或异体(亲属或尸体)来源获得。有效的结膜替代物可以阻止受损的、缺乏上皮的睑球表面接触，同时提供角膜、结膜上皮生长的相对健康的纤维胶原支架，可采用自体球结膜、自体口唇黏膜、羊膜等。睑球粘连手术的基本原则为病变切除+干细胞移植+结膜修补、穹窿成型。但是由于睑球粘连累及范围、程度、形态各有不同，临床上并无定式，如何合理选择手术方式?我们认为角膜缘干细胞的优选顺序为自体、亲属、尸体；结膜替代物的优选顺序为自体球结膜、羊膜、自体口唇黏膜、异体结膜[41。具体的选择则依据睑球粘连分度、结膜缺损面积、角膜中国实用眼科杂志2010年8月第28卷第8期Chin J Pract Ophthalmol，August 2010，Vol 28，No．8受累程度具体分析。I度、Ⅱ度患者相对容易，首先松解粘连瘢痕组织，结膜缺损较少、角膜缘功能基本正常者可选择单纯羊膜移植；结膜缺损略大，角膜缘受累少于1／4者，选择患眼未受累健康区域结膜角膜缘移植，角膜缘受累1／4 1／2者，选择对侧眼结膜角膜缘移植。Ⅲ度、Ⅳ度则较为复杂，大部分均合并角膜组织缺损、混浊、瘢痕、新生血管形成等，必须彻底去除病变角膜组织方可使患者获得有用视力。根据病变累及深度选择合适剖切深度，角膜病变较浅者可彻底板层剖切后表面覆盖多层羊膜即可；病变略深者需行板层角膜移植术(或深板层角膜移植术)，根据病变累及形状及范围灵活制备相应植片，Ⅳ度患者可行全板层角膜移植术。角膜缘干细胞移植首选自体对侧结膜角膜缘组织，但取材弧长不应超过10mm，亲属间结膜角膜缘移植可取自双眼，最好选择术前组织配型检查合适者。取材部位应选择相对健康部位，最好为颞上方，取材范围要充足，取材深度角膜侧达上皮基底膜，巩膜侧达固有层。无条件行自体或亲属间结膜角膜缘移植可行尸体结膜角膜缘移植，移植后应使用强力有效的激素及免疫抑制剂。自体结膜首选同侧，其次为对侧，取材宽度小于1／3象限，高度小于8turn，注意勿损伤穹窿结膜，保护好筋膜。自体口唇黏膜用于修补较大面积结膜缺损，但组织结构与正常结膜组织还有一定差异，多用于睑结膜和穹窿部结膜的修补。首选下唇黏膜，面积应比预计缺损大20％ 30％。商品化的羊膜组织具有来源丰富、使用方便的特点，可广泛应用于各种结膜缺损，目前公认羊膜只是为眼表干细胞的再生提供一个含基底膜和基质成分的胶原支架，并不能完全替代结膜移植，可视为结膜及口唇黏膜移植的有效补充。2．注意事项(1)行睑球粘连分离：尽可能清除增殖的瘢痕组织，完全松解睑球粘连，至眼球活动和睑裂闭合无明显受限。切口先从睑结膜面开始，要保留部分睑缘组织，要避免损伤睑板和眼外肌，尽可能在直视下采用锐性分离，如睑球粘连面积过大，术中不强求一次性完全分离睑球粘连，可在病情稳定后行再次睑球粘连分离联合自体球结膜移植术。(2)结膜、角膜缘、角膜植片：位置、形状、大小要与植床匹配，缝合确实固定于深层组织(睑板、巩膜等)，各种组织尽量细密缝合，不留死角，止血应适当。(3)综合治理眼表结构：如有倒睫、睑裂闭合不全、睑内翻等先期手术解决。泪液分泌异常应注重人工泪液的合理应用，必要时配合角膜接触镜、泪点塞、睑缘缝合等。(4)注重药物治疗：合理应用激素、人工泪液、免疫抑制剂、抗生素，全身用药注意毒副作用。参考文献1 高明宏，蓝平，元红，等．异体结膜角膜缘移植治疗重症服表疾病lJ】．中国实用眼科杂志，2005，23：1328—1330．2 谢立信，史伟云．角膜病学[M】．北京：人民卫生出版社，2007：316-321．3 S Jain and A Rastogi．Evaluation of the outcome of amniotic membranetransplant-tation for ocular sulface reconstruction in symblepharon[J1．Eye，2004，18：1251—1257．4 Ahmad K，Gabriela B，Victerio C，et a1．Su哂cal Strategie8 for FornixReconstruction Based On Symblepharon Severity[J]．Am J Ophthalmol，2008．146：266-275．(201O—Ol收稿)

深板层角膜移植手术经验探讨于静 高明宏 年春志 蓝平【摘要】 目的为提高手术成功率，探讨深板层角膜移植术的适应证及手术技巧。方法对内皮功能正常的角膜基质病变患者行深板层角膜移植术28只眼，术中采用角膜基质层间注入生理盐水或2％甲基纤维素分离方法，观察术中并发症、术后角膜透明度及术后视力提高等指标。结果19只眼术中未发生后弹力层穿孔，术后植片透明。术中发生后弹力层微或小穿孔9只眼，未行任何处理，其中有3只眼术后出现角膜植片轻度水肿、角膜层间有少量积液，经加压包扎及口服醋氮酰胺，积液在2周内逐渐吸收；另外6只眼术后前房形成良好，植片透明，无角膜层间积液。术后1年随访，28只眼中22只眼植片透明，6只眼角膜半透明。1只眼角膜被铁水烧伤后遗血管翳性混浊患者于术后8个月发生上皮型排斥反应，经药物治疗角膜逐渐恢复透明，无新生血管长入。15只眼最佳矫正视力达0．3～0．6，7只眼达0．1～0．3(含0．3)，6只眼达0．05～0．1。结论目前临床上相当部分用穿透性角膜移植治疗的内皮功能正常的角膜基质病变将可以被深板层角膜移植取代。只要掌握好手术适应证，提高手术操作技术，减少术中并发症及加强术后管理，可提高手术成功率。【关键词】 角膜移植；深板层深板层角膜移植术(De印lamillar keratoplasty，DLKP)是指在板层角膜移植的基础上，将受体病变的角膜基质组织完全剖切去除，直至暴露后弹力层，将已去除后弹力层及内皮层的供体角膜移植在含完整受体后弹力膜的植床上。此技术由Anwar~ 11974年首先报道。由于深板层角膜移植术既减少了眼内手术并发症的危险和由内皮细胞引起的排斥反应，又能达到视力的良好恢复，近年来逐渐成为众多学者研究的热点。我们对28眼角膜内皮功能正常的角膜基质病变患者施行深板层角膜移植术，取得了可喜疗效。现报告如下。资料与方法1．对象：选择2000年6月至2004年3月住我院的内皮功能正常的角膜基质病变患者28例(28只眼)，其中，上皮基底膜营养不良3只眼，颗粒状角膜营养不良2只眼，单疱病毒性角膜溃疡后角膜白斑l2只眼，细菌性角膜溃疡后角膜白斑6只眼，角膜爆炸伤合并深层异物2只眼，角膜铁水烧伤、化学伤后遗血管翳性混浊3只眼。术前视力：l5只眼为手动／眼前，8只眼为指数／lm，5只眼为0．05～0．1。A超检测角膜厚度界于400-600gm之间。裂隙灯检查l 8只眼的角膜基质混浊浓厚，致使瞳孔及作者单位：l10016 沈阳，沈阳军区总医院眼科通讯作者：于静· 论 著·虹膜纹理视不清，角膜深层可见新生血管，但无角膜明显变薄及溃疡穿破，无角膜上皮及基质层水肿(可视为内皮功能正 ：】)。10只眼角膜灰白色混浊位于基质浅层，深基质层透明，角膜浅层可见新生血管。眼压正常。B超检查视网膜及玻璃体未见异常。2．供体：选取尸体眼球，常规无菌处理，用l ml注射器抽空前房水后注入无菌空气，保存于一l96℃液氮中3个月以上。3．手术方法(1)植床的制作：选大小适宜的环钻(一般直径为7～7．5 mm)制作植孔，植床均匀切至3／4厚度时，用角膜镊提起环切口边缘，锐刀在板层纤维间分离，尽量将角膜混浊区及新生血管剖切干净。剖至基质深层，做一小切口插入钝性灌注头，缓慢注入生理盐水或2％ 甲基纤维素，直至角膜基质变白、膨胀变厚为止。用钝刀剖切已分离的基质深层，直至显露出整个瞳孔区光滑的后弹力膜。(2)植片的制作：将液氮中保存的全眼球移入40C水浴中复温2min，使眼球完全解冻。用大于植床0．15 mm的环钻钻透角膜，用显微镊子撕除角膜后弹力层及角膜内皮。(3)缝合植片：用10-0尼龙线将植片间断缝合于相应的植床上，缝合深度达4／5以上角膜厚度。结膜下常规注射庆大霉素2万u及地塞米松2．5mg。(4)术后处理：术后加压包扎2天。全身静滴中国实用眼科杂志2007年l1月第25卷第ll期Chin JPractOphthalmol，November2007．Vol 25，No．1l排斥反应。本组仅有l例角膜铁水烧伤后遗血管翳性混浊患者行大植片深板层角膜移植，术后8个月发生轻度上皮型排斥反应，经激素药物治疗，植片完全恢复透明，无新生血管长人。2．手术操作要点：深板层角膜移植术手术难度大，术中易穿破后弹力层进入前房。手术者于术前必须测量角膜厚度、牢记患眼角膜各部位的厚度及病灶分布的情况。我们的经验是术中如出现后弹力层微小穿孔，手术可继续进行；如后弹力层出现小穿孔、房水逐渐外溢、前房变浅，可根据角膜基质残留厚薄决定方案。如角膜基质残留较多较厚时可把剖开的角膜板层重新覆上并于其上滴少量粘弹剂，减少房水外溢、维持前房深度，改从其它部位继续剖切，最后再剖切破口处；角膜基质残留较少较薄、角膜病灶及新生血管已切除干净，则结束植床的剖切。破口往往在植片缝合后可自行闭合，手术结束时前房即已恢复。本组28例有9例术中发生后弹力层微或小穿孔，发生率为32％，术中未发生较大的后弹力层撕裂而被动改为穿透陛角膜移植术，这与我们对角膜各层剖切采用不同手术技巧、灵活处理有很大关系。(1)浅基质层的处理：采用锐刀逐层剖切法，即在全混浊的植床，角膜中央环钻深切至3／4角膜厚度，找准开始启动的深度后在微型有齿镊夹持对抗下锐刀分离基质，刀尖并非真正的切割，而是在板层纤维间滑动。如此往复，完成2～3轮板层剖切至深基质层。由于剖切系沿小板间隙进行，使植床剖切平面光滑，且手术安全、没有穿孔的危险。(2)深基质层的处理：采用层间注人生理盐水或2％甲基纤维素并钝性分离，具体如下，在深基质环钻沟槽处作一小切口，沿切口底部插入钝性灌注头注入盐水使残余基质变厚，然后用钝刀沿切口剥离成口袋状，将虹膜恢复器伸人袋内潜行，完成全周剥离，继而以角膜剪沿环钻划界剪切剥起的基质，完成新一轮板层剖切。(3)植床新生血管的处理：因后弹力层有很强的弹性和抵抗力，故新生血管不能穿过后弹力层。当基质深层有新生血管时，剖切时植床上会有血管渗血，可以找到角膜缘血管伸人到植床部位，电凝封闭血管。同时也提示，要进一步剖切植床，使位于基质深层内、角膜后弹力层前的新生血管彻底剖切干净。(4)暴露后弹力层方法：当打开后弹力层与最深层基质问的平面时，可凭借粘弹剂的推注力，将粘弹剂注入后弹力层与基质层间的潜在性间隙内，由此可以使后弹力层安全、完整地同基质层分离开。后弹力层完全显露的特征是：因后弹力层本身的张力和眼内压的作用下，后弹力层呈半球状膨隆；由于其表面已无粗糙的基质纤维层存在，故在手术显微镜下光滑透明如水滴状，虹膜纹理清晰可视。深板层角膜移植术具有安全、并发症少的优点，目前临床上相当部分用穿透性角膜移植治疗的内皮功能正常的角膜基质病变将可以被深板层角膜移植取代，这将部分缓解我国角膜移植供体材料短缺的问题。只要掌握好手术适应证，提高手术操作技术，减少术中并发症及加强术后管理，可提高手术成功率。参考文献l Anwar M．Technique in lamellar keratoplasty．Trans Ophthalmol SocU K，1974，94：163．2 杉田润太郎，近藤顺子．表层角膜移植E深层角膜移植．眼纪，1994，45：123．3 Trimarchi EPoppi E，Klersy C，et a1．Deep lamellar kemtoplasty．Ophthalmologica，2001，215：389．4 Hirano k，Sugim J，Kobayashi M．Separation of corneal stroma andDescemefs membrane dunng deep lamellar kemtoplasty．Cornea，2002，21：196．5 Shimazaki J，Shimmura S，Ishioka M，et a1．Randomized clinicl trialof deep lamellar keratoplasty VS penetrating keratoplasty．Am JOphthalmol，2002，134：l59．

累及黄斑的视网膜脱离巩膜扣带术后中心凹显微结构及视力变化 禹海 高明宏 夏国英 王颖【摘要】 目的应用高清频域光学相干断层扫描(SD—OCT)观察累及黄斑的视网膜脱离扣带术前后黄斑中心凹的显微结构变化，评估其对术后最佳矫正视力(BCVA)的影响。方法回顾性研究分析22例一次性手术成功的累积黄斑的视网膜脱离患者的资料，术前及术后1月，3月应用SD—OCT观察中心凹显微结构变化，测量黄斑脱离高度及外核层(ONL)厚度。结果22例患者术后1月13例(59％)有黄斑下积液。发病年龄、术前ONL厚度与术后BCVA不相关，而病程、术前视力、黄斑脱离高度、脱离范围、术后ONL厚度及术后有无黄斑积液均与术后BCVA显著相关( 0．046，0．0001，0．0007，0．036，0．O1 1，0．002)。术后有黄斑积液眼与无黄斑积液眼术后视力差异有统计学意义(U=25，P<0．05)，有积液眼术前黄斑脱离高度明显高于术后无黄斑积液眼(U=5，P<0．01)。黄斑脱离后出现以下几种形态改变：视网膜水肿、神经上皮层间分离、内外核层囊肿、光感受器内外节层连接(IS／OS)缺失、神经上皮外层波浪状改变及色素上皮层颗粒状改变。结论 持续的黄斑脱离是影响视网膜脱离扣带术后视力恢复的关键因素，SD—OCT是手术前后观察中心凹的显微结构变化及评估视力预后的可靠手段。【关键词】高清频域光学相干断层扫描；视网膜脱离；中心凹显微结构；巩膜扣带术FoveM m icrostructure and visual acuity after scler buckling procedure for m acula——of retinal detach——rnent YUHai，GAOMing-hong，XIA Guo-ying，WANG YingDepartmentofOphthalmologyGeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand，Shenyang J10015，China[Abstract] 0hjeetive To evaluate foveal microstruc~u'e changes in eyes with successful scleral buck—ling procedure of rhegrnatogenous retinal detachments．Methods This retrospective study included 22 eyes of22 patients with macula-of rhegmatogenous retinal detachment．The fimdus examination was conducted followedby special-domain optical coherence tomography (SD—OCT)to assess the preoperative and postopera—tive foveal microstructure included height of macular detachment and thickness of the outer nuclear layer．Pre—operative and postoperative factors analyzed for their association with postoperative best—corrected visual acuity(BCVA)and foveal microstmcture changes．Results Residual macular detachment was fomad in l 3 eyeswith SD—OCT 1 month postoperatively．Age，preoperative thickn ess ofthe outer nuclear layer did not influencepostoperative BCVA．The duration of macular detachm ent，worse preoperative visual acuity，height of macu·lar detachm ent，postoperative thickness ofthe outer nuclear layer and postoperative foveal fluid were importantnegative prognostic factors for postoperative BCVA．The macular anatomic abnormalities were detected bySD—OCT included macular edema，intraretinal separation，intraretinal cyst，nndulation of the outer retina，dropout of the photoreceptor inner and outer segment layers in the fovea and graininess of pigm ent epitheliallayer．Conclusions Persistent macular detachm ent is the most important factor for postoperative BCVA．SD—OCT is a valuable tool for evaluating foveal micro—structural changes and predicting visual recovery．Ⅱ【ey words] Spectral-domain optical coherence tomography；Rhegrnatogenous retinal detachment；Foveat microstructure；Scleral bucklingDOI：10．3760／cma．J．issn．1006—4443．2010．06．015中国实用眼科杂志2010年6月第28卷第6期Chin J Pratt OphthMmol，June 2010，V0l 28，No．6孔源性视网膜脱离常导致中心视力的损害，尤其在视网膜脱离累及黄斑时，即使手术使视网膜成功复位其术后视功能恢复依然较差，‘常常表现为视力的不完全恢复，视物变色、变形等，而这种视功能的损害被认为与视网膜脱离时黄斑的损害有关。既往的研究发现术后视力的恢复与术前黄斑脱离的高度和持续时间有关【 2】。在实验性视网膜脱离动物模型研究中发现视网膜脱离后最早12h内即可在外核层发现光感受器细胞的凋亡，而这种器质性损害与视网膜复位后视功能无法完全恢复密切相关【3I4】。在视网膜脱离术后，常规的裂隙灯前置镜及眼底镜检查很难发现黄斑部细微的结构改变。光学相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)是一种非侵人性检查，可以显示视网膜脱离时黄斑部的细微结构改变。许多应用OCT检查的研究显示术后视力恢复较差与黄斑部积液残留、黄斑部囊肿、视网膜层间分离等改变有关【 。然而普通OCT的轴向扫描分辨率只有10 m，其对于黄斑部精细结构观察有所欠缺。新一代高清频域OCT(SD—OCT)~够以快于传统(时域)OCT约7O倍的速度获取OCT图像数据，不仅分辨率可达到5 m，而且可以提供3维图像及3个层面的分层检查，对于视网膜脱离前后黄斑部的精细结构观察提供有效的手段。我们应用SD—OCT研究了累及黄斑的孔源性视网膜脱离患者手术前后的黄斑部精细结构变化与术后最佳矫正视力(best—corrected visual acuity，BCVA)的关系，以评估黄斑改变对术后视力的影响。资料与方法1．临床资料：回顾性分析本院2008年4月至2009年4月入院的孔源性视网膜脱离累及黄斑的患者。入选标准为PVRB级以下，全部由同一医生行巩膜扣带术，一次性手术成功视网膜复位，术后随访未出现新裂孔及复发的患者。视网膜巨大裂孔、高度近视、二次手术、既往有内眼手术或眼底病史及明显白内障影响视力的患者除外。人选病例共22例22只眼，其中男性l=4例(14只眼，63．6％)，女性8例(8只眼，36．3％)，年龄15～59岁，平均(34．57±15．12)岁。发病至手术时间3 120d，平均(28．90±30．63)d，随访3-6月。2．方法：所有患者术前及术后随访过程中均行全面的眼科检查，包括最佳矫正视力，裂隙灯，裂隙灯前置镜，间接眼底镜，术前及术后1月，3月的SD—OCT (Cirrus HD—OCT，Carl Zeiss MeditecInc)检查。患者均由同一手术医生行标准巩膜扣带术，包括裂孔冷凝，术中根据情况决定放液与否，放射或节段状硅海绵巩膜外垫压。BCVA为方便统计换算成最小分辨角的对数(LogMAR)。SD—OCT均由同一医生操作，利用CirrusHD—OCT特有的重复扫描功能使术前、术后的检查条件基本相同。测量黄斑脱离高度、中心凹外核层厚度、观察黄斑部精细结构变化。黄斑脱离高度为色素上皮层内侧至外界膜层(ELM)内侧距离，中心凹处外核层厚度为外界膜至中心凹内表面厚度，均行3次横向及轴向切面测量，取平均值。3．统计学分析：以术前及术后1月SD—OCT检查结果进行统计分析，术后3月视力作为术后BCVA。患者年龄、视网膜脱离时间、脱离范围、黄斑脱离高度、术前最佳校正视力(LogMAR)、术前及术后中心凹ONL厚度等与术后最佳矫正视力(LogMAR)间的相关性用Spearman检验分析。术后有无黄斑下积液间的各项比较用Mann—Whitney U检验分析。所有数据以平均值±标准差表示，以P<0．05为差异有统计学意义，采用SPSS16统计学软件。结 果1．一般情况：全部22例(22只眼)均一次性手术成功，其中环扎2例(9％)，放液3例(13．6％)。术后检眼镜下检查裂孔封闭，视网膜复位，随访期内未出现视网膜脱离复发。术后1月OCT检查发现黄斑下积液有l3例(59％)，随访3月消失2例，6月消失2例。为方便统计，以术后1月出现黄斑下积液者为术后有积液，同时测量术后1月黄斑脱离高度及ONL厚度，以术后3月BCVA为术后BCVA。术前、术后一般眼科检查结果见表1。本组病例统计发现发病年龄(R=0．115，P=-0．611)、术前ONL厚度与术后BCVA不相关，而术前视力、黄斑脱离高度、脱离范围及术后ONL厚度均与术后BCVA显著相关(P<0．05)。尤其是术前视力、黄斑脱离高度及术后黄斑下积液与术后BCVA相关性更加密切(P<0．01)。由于视网膜下放液及环扎例数较少，未区分不同术式与BCVA关系。2．OCT检查形态学结果：由于高清频域OCT(SD—OCT)分辨率较高，可实时活体观察视网膜的十层结构，且可以提供3维图像及3个层面的分层检查，因而为临床观察视网膜脱离患者术前、术后黄斑中国实用眼科杂志2010年6月第28卷第6期Chin J Pract Ophthalmol，June 2010，Vol 28，No．6ELM完整，一种为IS／OS连接和ELM均遭到破坏。而后一种的预后视力相对较差，因为这预示着不仅IS／OS连受到损害而且这种损害扩展到光感受细胞体及中心凹的Muller细胞锥尖部。我们的病例未观察到第二种损害，而且由于例数较少，因而未就黄斑的形态改变进行统计学分析，但只是IS／OS的破坏不能解释术后无此改变的患者视力预后不佳的原因。Li等_l3J的研究证实神经上皮层间分离、内外核层囊肿、神经上皮外层波浪状改变均与术前及术后视力显著负相关。这些不同研究之间的差异可能和样本数量，研究者所用OCT不同等因素有关，其准确评价尚需进一步研究。除了形态学的观察，我们测量了手术前后ONL层的厚度变化及黄斑区视网膜脱离的高度。发现术前黄斑脱离高度及术后ONL厚度与术后视力呈显著负相关，这与Maruko等『l2J的发现一致。术前黄斑脱离高度在术后黄斑未复位眼明显高于术后黄斑复位眼，说明术前黄斑脱离的高度在一定程度上决定了术后黄斑能否早期复位。虽然术前ONL厚度与视力预后无关，但术后ONL厚度明显小于术前ONL厚度，说明其与黄斑脱离有一定的联系。而进一步分析我们发现虽然术后有黄斑积液眼的ONL厚度与无积液眼ONL厚度无统计学差异，但其均值大于后者结合前面提到术后ONL厚度与术后视力呈显著负相关，因而ONL增厚可能在一定程度上影响着术后有黄斑积液眼的视力恢复。持续的黄斑下积液及其对外层视网膜的压力和无法由色素上皮细胞及脉络膜得到足够的营养供应可能导致了黄斑脱离时ONL的增厚。综上所述，黄斑脱离是影响视网膜脱离术后视力恢复的最主要因素。黄斑脱离的范围、高度及术后ONL厚度均对术后视力产生明显影响。长时间的黄斑脱离常导致黄斑部显微结构的改变，而SD—OCT能够精确发现黄斑部的精细结构改变，对于预测术后视力的预后提供良好的帮助。参考文献l Lecleire—Collet A，Murmne M ，Menard JF，et a1．Predictive visual out—come after macula—of retinal detachment surgery using optical coherencetomography[J]．Retina，2005，25：44-53．2 Hassan TS，Sarrafizadeh R，Ruby AJ，et a1．The efect of duration ofmacular detachment on results after the scleral buckle repair of primary，macula-of retinal detachments 【J】．Ophthalmology，2002，109：146-152．3 Hisatomi T，Sakamoto T，Goto Y，et a1．Critical role of photoreceptorapoptosis in functional damage after retinal detachment【J1．Curt EyeRes，2002，24：161—172．4 Yang L，BuM D，Arroyo JG，et a1．Preventing retinal detaehment-associatedphotoreceptor cell loss in Bax—deficient micefJ1．Invest Ophthal—mol Vis Sci，2004，45：648—654．5 Hagimura N，Iida T，Suto K，Kishi S．Persistent foveal retinal detachmentafter successful rhegmatogenous retinal detachment surgery[J]．AmJ Ophthalmol，2002，133：516—520．6 沈丽君，葛丽娜，汪朝阳，等孑L源性视网膜脱离手术复位后黄斑下积液[J1．中华眼科杂志．2008，44(3)，223—227．7 Wolfensberger TJ．Gonvers M．Optical coherence tomography in the e—valuation of incomplete visual acuity recovery after macula-of retinaldetachments[J]．Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2002，240：85-89．8 Salieone A，Smiddy WE，Venka~aman A，et al，Visual recovery afterseleral buckling procedure 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乙醇对角膜上皮瓣活性及基底膜分离定位研究 陈颖欣 蓝平 高明宏 范忠义 宋福林 徐旭 于静【摘要】 目的探讨不同乙醇作用时间对角膜上皮瓣活性的影响，并确定角膜上皮瓣的解剖分离层面。方法 按标准准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术(LASEK)方法制备7只尸体眼角膜上皮瓣，其中对照组1只眼，其余6只分为A、B、c 3个组，每组2只眼，乙醇浸润时间分别为2O、3O和40 S。对7只眼进行HE、增殖细胞核抗原(PCNA)、层黏连蛋白免疫组化及Ⅶ型胶原免疫荧光染色，评价角膜上皮瓣细胞活性，确定LASEK手术中角膜上皮瓣的解剖分离层面，采用)(2检验分析。结果 角膜上皮瓣为复层上皮细胞组织，没有Bowman S层和角膜基质成分，PCNA阳性细胞率为A组>B组>C组，其laminin染色在角膜床和上皮瓣基底膜一侧均有呈片段样棕色条纹状，其collagen VlI染色阳性反应呈一条绿色线形，而且只存在于角膜床，上皮瓣基底膜侧不着色。结论 角膜上皮瓣活性随乙醇浸润时间延长而降低；乙醇浸润法制备角膜上皮瓣的组织分离层面位于角膜上皮基底膜内，并且定位于基底膜的透明层和致密层之间。f中华眼 杂志，2008，44：1088—1092)【关键词】角膜切削术，上皮下，激光； 上皮，角膜； 基膜； 增殖细胞核抗原； 层粘连蛋白； 乙醇Viability of corneal epithelial calls and cleavage of corneal basement after ethan ol efectCHEN Y／ng—xin，L～N P ，GAO Ming—hong，FAN Zhong-yi soNG Fu—t XU Xu YU Jing．Department ofOphthalmology，the General Hospital ofShenyang Military Command，Shenyang 110016，ChinaCorresponding a~hor：CHEN M 一xin，Ema il：cyx156@ 163．corn【Abstract】 objective To evaluate the viability of comeal epithelial cells and to determine theanatomic cleavage on the epithelial basement membrane after various exposure times to 20％ etllanol duringepithelial flap preparation in laser．assisted subepithelial keratectomy(LASEK)in cadaver eyes．MethodsSix human cadaver eyes were exposed to 20％ ethanol for 20，30 and 40 seconds(2 eyes for each group)，and anotller one eye was used as the contro1．PCNA staining was performed to determ ine the viability ofcorneal epithelial ceils．Immunofluorescence staining using monoelonal antibodies against collagen Ⅶ ．andimmun0hist0lo西c81 staining using monoclonal antibodies against laminin were performed to detect theanatomic location of tlle cleavage plane on tlle corneal epithelial flaps created by 20 seconds exposure to 20％ethanol in cadaver eyes．Results Hematoxylin and eosin staining of epithelial flaps revealed a coherentstratified epithelium．The PCNA positive rates of the epithelial cells in the flap decreased in the 20．secondgroup，30-second group and 40-second group successively．Immunohistological staining to laminin was patchyin the lifted flap and the remaining corneal basement membran e．Immunofluorescence to collagen VII．the maincomponent of anchoring fibrils remained exclusively in the corneal bed．Conclusions Viability of theepithelial flap decreased with longer time exposure to ethano1．The cleavage plane of the ethanol-treatedcorneal epithelial flap iS located between the 1amina lucida and the lamina densa of the basement membranewhere laminin forms hemidesmosome．(C J Ophthalmol，2008，44：1088—1092)【Key words】 Keratectomy，subepithelial，laeser—assisted； Epithelium，corneal； Basementmembrane； Proliferating cell nuclear antigen； Laminin； Ethanol准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术(1aser-assistedsubepithelial keratectorny，LASEK)中，乙醇作用于角膜上皮和上皮基底膜的机制尚未完全清楚，探讨乙醇对角膜上皮瓣细胞活性影响和确定上皮瓣组织学分离层面对临床有重要指导意义。本文以人的新鲜尸体眼为材料，应用HE染色、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)检测及免疫Chin J Ophthalmol，December 2008，Vo1．44，No．12组化和免疫荧光染色方法，研究LASEK中20％乙醇对角膜上皮细胞增殖活性影响，并在组织学上确定角膜上皮瓣基底膜的解剖分离层面。材料和方法一实验材料与分组死亡0．5 h内摘除的新鲜尸体人眼球7只(由沈阳军区总医院眼库提供)。对照眼1只，其余6只分为A、B、c 3组，每组2只眼，20％乙醇浸润时间分别为20、30和40 s。3组眼球按标准LASE方法 制备角膜上皮瓣。用一种特制的微环钻在角膜上皮面做一直径8 mm、深70 m的预切口。环钻的设计可以在角膜上方12点处预留80。～100。左右的缺口，此处是角膜上皮游离片的枢链。再将特制的用于储放酒精的圆锥放在眼表角膜上，将预先配制好的20％ 乙醇溶液，0．1 ml注入酒精圆锥中，分别按分组停留20、3O、40 s，立即用吸水海绵吸干，并用BSS反复冲洗眼表。自4点或6点位开始用上皮分离锄向12点方向分离上皮瓣，并翻卷堆积至12点处，然后将上皮瓣复位。将7只眼球沿角膜缘后5 mm环形切开，弃眼后节，制备角膜组织石蜡切片。二、HE染色取石蜡切片于烤箱中烤片2 h(60℃)，二甲苯脱蜡，经梯度乙醇至水，常规染色。三、PCNA检测石蜡切片脱蜡后，用PBS(pH值7．4)冲洗3次，每次3 min。根据抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复(高压水浴修复3 min)。每张切片加3％过氧化氢溶液50 1，室温下孵育10 min，阻断内源性过氧化氢酶，PBS冲洗。每张切片加第一抗体(鼠抗人PCNA单克隆抗体)50 l，室温下孵育60 min，PBS冲洗。去PBS液，每张切片加二抗辅助剂(中山PV900)50 l，室温下孵育15 min，PBS冲洗。去PBS液，每张切片加二抗(酶标抗鼠／兔聚合物)50 1，室温下孵育15 min，PBS冲洗。去PBS液，每张切片加新鲜配制的DAB显色液100 l。显微镜下观察3—10 min，阳性显色为棕色。自来水冲洗，苏木素复染，0．1％盐酸分化，自来水冲洗，PBS冲洗返蓝。切片经过梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封片。四、层黏连蛋白检测第一抗体为鼠抗人层黏连蛋白单克隆抗体，其余同PCNA检测。五、胶原Ⅶ检测石蜡切片脱蜡后，用PBS(pH值7．4)冲洗3次，每次3 min。根据抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复(高压水浴修复3 min)。每张切片加3％过氧化氢溶液5O l，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化氢酶，PBS冲洗3次，每次3 min。去PBS液，每张切片加第一抗体(鼠抗人胶原Ⅶ单克隆抗体)50 Ixl，室温下孵育60 min，PBS冲洗3次，每次5 min。去PBS液。每张切片加荧光素50 l，室温下孵育15 min。荧光显微镜下观察染色结果并摄片。六、统计学分析方法每例涂片随机选择5个不重复高倍视野(x400)，取细胞平均值，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比。应用R×2列联表的x 检验(多个计数资料比较)。结 果一HE染色LASEK制得的角膜上皮瓣与角膜基质床明显分离，瓣向上方掀起，在光镜下显示为复层上皮细胞组织(图1，2)。二、PCNA检测(表1)PCNA阳性反应集中分布于细胞核，呈棕黄色颗粒状，胞质不显色。对照眼角膜上皮PCNA阳性细胞率最高(图3)。20％乙醇浸润20 s后角膜上皮瓣PCNA阳性细胞弥散分布于整个角膜上皮瓣(图4)；浸润30 s后角膜上皮瓣PCNA阳性率略显降低，棕黄色颗粒数目减少(图5)；浸润40 s后角膜上皮瓣PCNA阳性率明显递减(图6)。4组角膜上皮瓣中的PCNA阳性细胞所占比率由高到低排序，依次为对照组、A组、B组和C组(x 检验，尸<0．01)。表1 4组新鲜尸体眼角膜上皮瓣中的PCNA阳性及阴性细胞率三、层黏连蛋白检测层黏连蛋白显色为棕色线条，在角膜床前弹力膜表面和掀起的上皮瓣基底膜组织上均见有棕色片中华眼科杂志2 0 0 8 年1 2 月第4 4 卷第1 2 期C h i n J O p h t h a l m o l ， D e c e m b e r 2 0 0 8 ， V 0 1． 4 4 ， N o ． 1 2图1 光镜下可见L A S E K 制得的尸体眼角膜上皮瓣与角膜基质床明显分离， 角膜上皮瓣向上掀起，蒂部与基质床相连H E 染色× 1 0 0图2 光镜下可见L A S E K 制得的尸体眼角膜上皮瓣为复层鳞状上皮组织H E 染色× 1 0 0 图3 光镜下可见对照眼P C N A 阳性反应集中分布于细胞核， 呈棕黄色颗粒状，胞质不显色P C N A 染色X 4 0 0 图4 2 0 ％ 乙醇浸润2 0 s 后光镜下可见角膜上皮瓣P C N A 阳性细胞弥散分布于整个角膜上皮瓣P C N A 染色~ 4 0 0段样染色( 图7 ) 。四、胶原Ⅶ 检测胶原Ⅶ 染色只存在于角膜前弹力膜， 显示为一条绿色的线形， 上皮瓣基底细胞侧染色为阴性( 图8 ) 。讨论L A S E K 是针对近视度数高而角膜相对较薄的患者的一种新的手术方法。术中应用2 0 ％ 乙醇浸润松解角膜上皮层， 制作角膜上皮瓣后用准分子激光进行原位切削， 再复位上皮瓣。该手术的安全性高于L A S I K 。P C N A 是一种细胞周期调节蛋白， 为D N A 多聚酶辅助蛋白，对D N A 多聚酶活性具有调节作用，其表达与细胞增殖活性密切相关。本文应用鼠抗人P C N A 单克隆抗体做免疫组化检测角膜上皮瓣的活性，结果显示经2 0 ％ 乙醇浸润2 0 、3 0 和4 0 s 后上皮瓣均可见P C N A 阳性反应颗粒位于细胞核， 呈现棕黄色，证明角膜瓣仍保持一定的活性， 而且其阳性率随乙醇浸润时间延长而递减。4 组的阳性率分别为9 9 ． 0 ％ 、8 9 ． 8 ％ 、7 4 ． 1 ％ 和4 9 ． 1 ％ ， 表明乙醇对角膜上皮的毒性随时间延长而增加， 这与K i m 等_2 0 在兔角膜上所做的实验研究结果一致。以往有学者对乙醇的浓度、应用乙醇的时间及其细胞形态学等进行了观察。C a m p o s 等M ’报道了应用1 0 0 ％ 乙醇处理2 m i n 后可引起兔眼角膜基质细胞的急剧减少。H e l a n a 等¨ 0 观察5 0 ％ 乙醇处理6 0 S 可使角膜细胞减少。K i m 等心0 曾观察到对兔眼应用2 0 ％ 乙醇后早期出现局部或广泛的微绒毛的损害，部分细胞的连接破坏及细胞内的水肿，这破坏随乙醇应用时间延长而加重， 认为乙醇对角膜组织的毒性不可忽视。然而大量研究发现L A S E K 术中，角膜上皮浸润2 0 ％ 乙醇1 5 ～ 3 0 s 后，大多数上皮细胞仍保持活性；4 5 s 后活性细胞与死亡细胞近似相等；6 0 s 后大多数上皮细胞死亡。所以应用2 0 ％ 乙醇作用时间控制在4 5 s 之内制作角膜上皮瓣已经成为常规。本文结果表明4 0 s 内角膜瓣仍保持一定的活性， 基本保持5 0 ％ 的活性上皮细胞。本文利用胶原Ⅶ 特异性抗体做免疫荧光法定位图5 2 0 ％ 乙醇浸润3 0 s 后光镜下可见角膜上皮瓣P C N A 阳性率略显降低， 棕黄色颗粒数目减少P C N A 染色× 4 0 0 图6 2 0 ％ 乙醇浸淮4 0 s 角膜上皮瓣P C N A 阳性率明显递减P C N A 染色× 4 0 0 图7 光镜下可见在角膜床前弹力膜表面和掀起的上皮瓣基底膜组织上均贝有棕色片段样染色免疫组化染色× 1 0 0 图8 荧光显微镜下可见胶原Ⅶ 于角膜前弹力膜显示为一绿线免疫荧光染色× 1 0 0研究，证实2 0 ％ 乙醇浸润后的分离层而位于上皮基底膜。胶原Ⅶ 是一种主要的固定纤维成分， 用来加强上皮基底膜与其下的B o w m a n 膜的粘接旧胶原Ⅶ 只特异性地存在于角膜基质床上， 而不存在于上皮瓣中，说明分离层面在上皮基底膜。这一分离层面的确定与A z a r 等一0 用电子显微镜研究结果是一致的。为了进一步确定上皮基底膜的确切分离部位，笔者用层黏连蛋白的特异性抗体做免疫组化染色、它们是半桥粒结构中的跨膜蛋白层黏连蛋白是基底细胞膜的主要成分之一， 也是透明层中形成半桥粒结构的主要成分。本文的实验结果显示，部分层黏连蛋白以不连续线形方式残留在角膜基质床上， 而另一部分层黏连蛋白在角膜上皮瓣基底膜一侧同样以不连续线形方式分布。基于免疫组化染色的证据，笔者推断出分离层面位于透明层与致密层的结合处，这里是半桥粒形成的部位。因此，基底膜的深层结构致密层，在L A S E K 术中仍遗留在角膜基质床上。近来研究发现2 0 ％ 乙醇浸润兔眼4 0 S 后导致角膜上皮增生强度比机械刮除角膜上皮后的增生j度低，持续时间短。乙醇浸润后的角膜上皮到一定的机械屏障的作用，使角膜上皮损伤后的，液中的细胞因子和损伤的角膜上皮释放的细胞E子，不能到达角膜基质细胞， 不能引发凋亡。乙醇毫润后的角膜上皮可能通过增多角膜表层上皮细胞移亡途径加快了角膜上皮的更新速度， 以防角膜上点的过度增生导致屈光回退和角膜混浊， 说明乙醇又角膜的损伤比较轻，修复比较快， 乙醇浸润过的上点对角膜基质细胞有一定的保护作用。因此， 目前{f1分子激光原位角膜磨镶术和L A S E K 仍然是准分j激光屈光矫正临床应用的主流技术。本文利用死亡0 ． 5 h 内摘除的新鲜尸体人眼秀进行研究， 7 只实验眼球均来自沈阳军区总医院剧库提供的自愿捐献眼球， 为离体实验而非活体实验严格遵守了医学伦理学的要求。然而， 离体眼球角膜上皮细胞的活性必然要低于活体眼， P C N A 染垂的活细胞一定低于正常值， 直接影响了乙醇对角雁上皮作用的真实结果， 但全部眼球是在离体后立且· 1092· 中华眼科杂志20o8年l2月第4_4卷第12期Chin J Ophthalmol，December 2008，Vo1．44，No．12投入实验的，基本保证了角膜上皮细胞的活性较少丢失。另外，尸体眼离体后失去眼球正常眼内压，眼表失去正常的张力，增加了制作角膜瓣的难度，需要细致的用上皮分离锄小心分离上皮瓣以免破损。参 考 文 献万修华，姚克．屈光手术新进展一LAsEK 国外医学眼科学分册，2oo1，25：331_334．Kim SY，Sah WJ，Lim YW ，et a1．Twenty percent alcohol toxicityon rabbit Corneal epithelial cells．Cornea，2002。21：388-392．Gabler B，Winkler C，Dreiss AK，et a1．Ⅵtality of epithelial celsafter alcohol exposure during lfiber-assisted subepithelialkeratectomy flap preparation．J Cataract Refract Surg，2002，28：1841．1846．Chen CC，Chang JH，Lee GB，et a1．Human corneal epithelial celviability and morphology after dilute alcohol exposure．InvestOphthalmol Vis Sci，2002，3：2593-2602．Okada Y，Saika S，Miyamoto T，et a1．AP一1 expression in ethan ol—treated corneal epithelium in vivo．Ophthalmic Res，2007，39：84—91．Campo s M ，Raman S，Lee M，et a1．Keratocyte loss after diferentmethods of de-epithelialization．Ophthalmology，1994，101：890—894．Helana M，Baerveldt F，Kim WJ，et a1．Keratoc~e apo ptosis after[8][9][10][11][12][13][14]corneal s~gery．Invest Ophthalmol Vis 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慢性移植物抗宿主病相关的干眼症一例 于静 年春志 高明宏 蓝平 肖卉干眼症是异基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病(chrnicgraft versus host disease，cGVHD)最多见的眼部并发症之一。Ogawa等 报道，患者一旦出现于眼症状，干眼症的病情发展迅速，虽不危及生命却严重影响生活质量。现将我院门诊随诊的1例异基因骨髓移植患者的眼部检查及治疗情况报告如下。患者男38岁慢性粒细胞白血病。于2005年l0月23日行异体骨髓移植术。供者为其胞姐，42岁。供、受者HLA配型全相合，ABO血型均为O型，手术后长期口服环孢素A治疗。术后4个月出现全身皮肤粗糙、局部皮肤变硬、色素沉着。术后145 d出现双眼红、干涩、畏光，视力下降。眼科检查：双眼视力0．5(矫正不应)。双眼睑及球结膜充血，角膜弥漫点、片状上皮干燥斑，荧光染色(+)。3点、9点位角膜缘血管网充血。KP(一)、Tyndall(一)，双眼瞳孔等大同圆，对光反射(+)。晶体、玻璃体透明，眼底检查未见异常。泪膜破裂时间(BUT)：右眼2 S，左眼3 S。Schirmer I：右眼1mm，左眼lmm：SchirmerⅡ：右眼1 mm，左眼2 mm。诊断：慢性移植物抗宿主相关干眼症。给予Smartplug泪点栓行双下泪小点阻塞，同时应用无防腐剂的人工泪液、表皮生长因子、0．1％CsA眼液点眼。1个月后复查，眼干涩、畏光症状缓解，结膜充血减轻，角膜上皮荧光染色点减少，泪膜破裂时间(BUT)：右眼3 s，左眼5 S。其余检查无变化。讨论异基因骨髓移植术后的重要并发症是移植物抗宿主病(graft versus host reaction disease，GVHD)，它是由于异基因供受者之间的次要组织相容性位点不同，移植物中淋巴细胞(主要是T细胞)识别宿主抗原而致敏、增殖、分化，直接或间接攻击受者靶细胞而发生的一种全身性、多器官的免疫性疾病。急性和慢性GVHD诊断标准：移植成功的造血干细胞移植患者出现皮肤和(或)肝功能障碍，伴或不伴有其他靶器官如眼部、唾液腺、口腔黏膜、胃肠道、肺损害 。以100 d作为急性或慢性GVHD分界。慢性GVHD发病率为32％～79％，其临床表现类似于多系统的自身免疫性疾病，如硬皮病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、原发性胆汁性肝硬化、扁平苔藓和嗜酸性肌膜炎等。眼部病变多为慢性病程，临床上以干眼症为最常见，还可表现为无菌性结膜炎，结膜纤维化瘢痕、睑球粘连，以及持续性角膜上皮损害，甚至角膜溃疡等。本例患者的眼部表现主要为泪液基础分泌量和反射性分泌减少、BUT缩短，角膜弥漫点、片状荧光染色斑。Ogawa等l引报道约50％造血干细胞移植术后存活患者发生干眼病，平均出现时间为(171±59)d。干眼症与术前全身放疗及化疗关系不大，只在术后伴随cGVHD发生，提示干眼病是造血干细胞移植后活化的异体免疫病理过程，而与药物治疗无关。干眼症发生的机制不清，一般认为，可能与结膜和泪腺受到免疫活性T淋巴细胞攻击有关。Ogawa等[41发现cGVHD病人的泪腺间质纤维化明显，并发现有大量的CD34+间质成纤维细胞，推测问质成纤维细胞通作者单位：1 10016，沈阳军区总医院眼科病例报告过产生大量的细胞外基质成分，在此疾病发病中作用重要。费文雷等 l给予此类患者角结膜印迹细胞检查：显示为结膜上皮细胞角化，结膜杯状细胞减少或消失，角膜上皮鳞状化生。术后患者虽然常规口服环孢素A等免疫抑制剂以防治cGVHD，但并未能遏制干眼症的发展，这可能与泪腺的药物浓度低、未达到抑制成纤维细胞的有效浓度有关 一。为发挥环孢素A的有效作用，我们通过改变给药途径即给予局部应用0．I％CsA眼液点眼，同时大量应用人 [泪液并行泪小点栓塞，达到了控制干眼症的目的。另外，也有报道应用FK506治疗cGVHD干眼症。FK506是1984年从链霉菌分离出的大环内酯类抗生素，尽管FK506的作用机制、药代动力学、副反应与环孢霉素A相似，但体外试验其抑制T细胞增殖反应能力比环孢霉素强100倍。Ogawa等 报告2例造血干细胞移植术后慢性移植物抗宿主病导致的严重干眼，1例口服CsA联合泼尼松龙治疗无效，改用FK506口服，眼表和其他器官的症状明显改善。费文雷等[91报道，0．05％FK506滴眼液，配合人工泪液、自家血清治疗cGVHD干眼症有效。慢性移植物抗宿主相关干眼症主要发生在异体骨髓移植术后，随着我国骨髓移植越来越广泛地开展，此并发症肯定会越来越多，眼科医生应该有所了解并能及时准确治疗，改善并提高患者的生存质量。参考文献1 Ogawa Y．Kuwana M．Dry eye as a major complication associated withchronic耵aft—versus—host disease after hematopoielic stem cell trans—plantation．Cornea，2003，22(7 Supp1)：SI9一$27．2 陆道培，主编．白血病治疗学．北京：人民卫生出版社，1992：342~346．3 Ogawa Y，Okamoto S，Wakui M，et a1．Dry eye after haematopoieticstem celltranspoantation．Br JOphthalmol，1999，83：1125—1130．4 Ogawa Y，Yamazaki K，Kuwana M ．et a1．Asignifical role of stromal fi—broblasts in rapidly progressive dry eye in patients with chronicGVHD．investOphthalmolVisSet，2001．42：111—119．5 费文雷，陈家祺，杜欣等．移植物抗宿主病相关的干眼病．中华眼科杂志，2003，39(11)：686—690．6 Johnsson C，Gerdin B，Tufveson G．Effects of commonly used immuno—suppressants on graft—derived fibroblasts． Clin Exp hnmunol，2004 136：405—412．7 Azzola A，Havryk A，Chhajed P，et a1．Everolimus and mycophenolatemoletil are potent inhibitors of fibroblast proliferation after lung trans—plantation．Transplantation，2004，77：275—280．8 Ogawa Y．et a1．Suceessfal treatment of dry eye in two patients withchronic graft——versus—-host disease with systemic adnfinistration ofFK506 and corticostemids．Cornea，2001；20(4)：430—432．9 费文雷，陈家祺，杜欣等．慢性移植物抗宿主病的重度干眼和局部FK506治疗．中国实用眼科杂志．2003，21(8)：606—608．

病灶切除联合冷冻及羊膜移植治疗蚕蚀性角膜溃疡的临床研究 徐旭 高明宏 禹海 周润海· 论著：技能体会·【摘要】目的探讨应用病灶切除联合冷冻及羊膜移植的方法治疗蚕蚀性角膜溃疡的有效性和安全性。方法选择2005年1月至2007年5月的蚕蚀性角膜溃疡患者，共l2例(14只眼)，病程为15 d至2年(平均3．5月)。所有患者均行病灶切除联合冷冻及羊膜移植术，术后随访5—24个月，裂隙灯显微镜观察角膜溃疡愈合及羊膜组织转归，荧光素钠染色观察角膜上皮的愈合情况。同时观察并发症及复发情况。结果眼部疼痛、畏光、流泪等刺激症状明显缓解，表层羊膜于3～7 d开始脱落或自溶吸收，内层羊膜与角膜组织牢固愈合。角膜溃疡在1~3周修复，角膜融解得到控制，角膜厚度增加。l4只眼中首次手术9只眼治愈，3只眼好转，治愈及好转率为85．71％，无并发症发生。结论病灶切除联合冷冻及羊膜移植治疗蚕蚀性角膜溃疡是有效、安全的。【关键词】蚕蚀性；角膜溃疡；病灶切除；冷冻；羊膜移植Focal lesion keratectom y com bined with cryotheraty and arnniotic m em brane transplantation in th em anagem ent of M ooren’S ulcerXU Xu，GAOM ing-hong，YUHal，ZHOU Run-hai Department ofOphthalmology，The GeneralHospital，ShenyangMilitaryCommand，Shenyang J10016，China[Abstract] Objective To examine the eficacy and safety offocal lesion keratectomy combined withcryotheraty an d amniotic membrane tran splantation in the treatment of Mooren’S ulcer．Methods Twelvepatients (14 eyes)with Mooren’S ulcer were treated with focal lesion keratectomy combined with cryotheratyan d anmiotic membrane tran splantation between Jan uary 2005 an d M ay 2007．The course of diseases was 15days to 2 years (mean 3．5 mouths)，All ofthem had a rapid progressive and painful periphery corneal ulcer．We investigated the healing of corneal ulcer and transformation of anmiotic membrane witll slitlampbiomicroscope，the integrity of corneal defect with fluorescein staining，complications an d ulcer recurrenceswere an alysed．Results All the cases were followed up for 5 to 24 months after operation ofthem ，symptomssubsided remarkably and immediately in all patients．Superficial amniotic membrane patches dissolved or shedon postoperative day 7-10，while the deeper grafts were adhered into the ulcer an d fused with the surroundingfibroblasts．Corneal ulcer healed within 1-3 weeks postoperatively with negative fluorescein staining，Cornealmelts were controlled．the corneal thickness was increased．A1l but 2 eye remained free ofulcer recurrence，thecurative rate was 85．71 ．No complication occurred．Conclusion Focal lesion keratectomy combined wi thcryotheraty and amniotic membrane transplantation is an efective and safe method for the treatm ent ofM ooren’S ulcer．[Key words] Mooren’S Ulcer；Focal lesion keratectomy；Cryotheraty； Amniotic membraneCransplan tation 蚕蚀性角膜溃疡是一种慢性、进行性、疼痛性角膜溃疡，初发于角膜周边部，沿角膜周边部延伸，向角膜中央匍行发展，最终累及全角膜【l1。我院应用病灶切作者单位：110016 沈阳，沈阳军区总医院眼科除联合冷冻及羊膜移植的方法治疗12例(14只眼)蚕蚀性角膜溃疡患者，获得满意疗效，现报道如下。资料与方法1．资料来源：2005年1月至2007年5月在我院眼科住院治疗的蚕蚀性角膜溃疡患者，共12例，单眼l0例，双眼2例，共l4只眼。男5例，女7例，平均年龄43．5岁(其中35岁以上8例，35岁以下4例)。所有患者均接受过激素、免疫抑制剂等药物治疗后继续恶化，患者均无确诊的免疫系统疾病。病程：15d至2年，平均3．5月，均有明显眼部疼痛及畏光流泪症状，最佳矫正视力光感～0．5，角膜溃疡进行缘呈特征性穿凿样浸润，溃疡宽度为2～5mm，溃疡深度为1／3～3／4角膜厚度，侵及时钟位4～l2点，均无角膜穿孔。2．手术方法(1)病灶切除：球后、球结膜下浸润麻醉，手术显微镜下彻底清除病变角膜、结膜及巩膜组织，在溃疡病灶进行缘外1mm处沿角膜病变区谨慎剖切，清除角膜溃疡及周边的坏死组织，暴露溃疡基底及两侧的正常角膜组织，角膜缘处板层剖切巩膜2mm，距溃疡区角膜缘5mm环行切除球结膜及其下的筋膜组织，暴露巩膜面，烧灼止血。(2)冷冻：采用二氧化碳干冰可控式冷冻仪(HB一801B型，扬州华康电子科技有限公司)对创面进行多点冷冻。顺序依次为：角膜溃疡进行缘、角膜溃疡表面、角膜缘、暴露巩膜表面，冷冻头温度依次为一50℃、一60℃、一60~C、一60℃ ，冷冻时间依次为8s、8s、10s、12s。(3)羊膜移植：选择冷冻干燥羊膜(由江西瑞济生物工程技术有限公司提供)复水，根据角膜溃疡的面积和深度，制作相应大小的内层羊膜植片，将羊膜组织折叠成双层或多层羊膜(3～5层)填塞于溃疡区表面，上皮面朝上，完整覆盖溃疡表面，用10—0尼龙线间断缝合固定于角巩膜缘和溃疡周围角膜浅基质处，再取单层羊膜覆盖于整个创面(上皮面朝上)，用10—0尼龙线将羊膜间断缝合4针固定于角巩膜缘处；然后将羊膜与球结膜创缘穿过浅层巩膜后对位缝合，尽量使羊膜贴附于创面上。(4)术后处理：术后可根据情况静脉滴注抗生素和地塞米松3～5d，典必殊眼膏涂眼，加压包扎3～5d，然后使用典必殊眼液点眼，待上皮愈合后滴用1％环孢霉素A滴眼液每天2～4次。术后7d拆除外层羊膜缝线，术后2周拆除内层羊膜缝线，也可以根据羊膜植片与角膜溃疡的愈合情况酌情考虑拆线时间。(5)观察指标：术后随访时间为5～24个月，定期复查视力及眼压情况，裂隙灯显微镜观察角膜溃疡愈合、羊膜组织转归，荧光素钠染色观察角膜上皮的愈合隋况。疗效判定标准：①治愈：无自觉症状，溃疡愈合或消除，角膜荧光素染色阴性；②好转：溃疡无扩大、加深，进行缘变平或呈坡行，可见新生血管形成，短期内(3个月)无复发；③无效：溃疡面继续扩大、加深，或短期内复发，药物不能控制。结 果1．视力和眼压：l2例(14只眼)视力变化情况见表1，术前视力在盲目范围者为8只眼，占手术总眼数的57．14％，术后视力在盲目范围者仍有6只眼，占手术总眼数的42．86％ ，从手术前后视力对比观察，术后增视者有4只眼，手术增视率为28．57％。l2例(14只眼)术后眼压均在正常范围。表1 l2例(14只眼)手术前后视力变化2．眼部情况：眼部疼痛、畏光、流泪等刺激症状明显缓解，7～10 d后症状基本消失。羊膜与角膜、巩膜层间无明显积液和间隙，表层羊膜于3～7 d开始脱落或自溶吸收，上皮逐渐修复，病变范围小于6个时钟位者多在术后10 d左右修复，病变范围超过6个时钟位者需2～3周修复。内层羊膜与角膜组织牢固愈合，溃疡平复，角膜平均增加约1／3角膜厚度，呈半透明状，无新生血管伸人。表面光滑，晚期遗留斑翳。3．复发情况：术后随访时间5～24个月，平均l4个月，l4只眼中首次手术9只眼治愈，3只眼好转，治愈及好转率为85．71％。其中1例42岁女患曾先后行单纯冷冻术、板层角膜移植术后，病情仍持续性加重，行病灶切除联合冷冻及羊膜移植后1次治愈，随访1年以上仍无复发。2只眼无效，其中1只眼因角膜溃疡面积较大，在术后15 d后再次进行冷冻及羊膜移植术后治愈，1只眼在术后3个月复发，行板层角膜移植术后治愈。4．并发症：无眼球穿孔、排斥反应、低眼压等并发症。讨 论1．发病机制及手术特点：蚕蚀性角膜溃疡，目前，尚缺乏特效治疗方法，总的原则是对轻症者首先采取积极的药物治疗，对疗效欠佳或重症患者采取手术治疗和药物治疗相结合的方法。尽管其病因及发病机制尚不完全明确，周边部角膜及邻近球结膜免疫功能亢进被认为是蚕蚀性角膜溃疡的重要始动因素 。针对上述发病机制，本手术彻底切除溃疡组织、角膜缘及其邻近结膜组织后，能够完成病变区的自身抗原、抗体及补体的清扫，病变区球结膜和结膜下组织被阻断在暴露的巩膜面以外，延迟与角膜缘的愈合，抑制病变部位过强的自身免疫反应。同时断绝胶原酶的组织来源，又能为健康角膜上皮的修复创造条件。冷冻进一步清除免疫坏死组织，免疫活性细胞和活性成份，阻断其恶性循环，中断免疫性炎症过程。起到类似“扩创”的作用，同时使感染的角膜细胞产生干扰素，增进邻近细胞对病原的抵抗力。但手术彻底清除病灶后残余角膜基质变薄，冷冻创伤反应较重，结膜缺损面积较大。在此基础上我们联合应用内、外层羊膜移植方法，外层羊膜主要发挥屏障作用，内层多层羊膜主要作为胶原基质用于角膜的重建。2．与板层角膜移植手术的比较：蚕蚀性角膜溃疡依病情严重程度，可采用单纯药物治疗、角结膜割冻或割烙术、板层角膜移植术、穿透角膜移植术、羊膜移植术等。板层角膜移植术目前是首选的手术治疗方法，陈家祺等嘲研究发现溃疡病灶切除联合球结膜切除联合板层角膜移植联合环孢霉素A滴眼治愈率为73．7％，董莹等旧研究发现板层角膜移植治疗蚕食性角膜溃疡治愈率为87．5％。本手术治愈率为85．71％。对于角膜供体材料缺乏，以及不具备行角膜移植术的医院来说，采用病灶切除联合冷冻及羊膜移植是一种安全有效的选择。同时角膜移植存在术后排斥反应等问题，角膜移植前先期对溃疡组织进行病灶切除联合冷冻及羊膜移植的方法，可以降低或灭活组织的抗原性，提供稳定的眼表，为后续进行的角膜移植术提供良好的基础和重要的补充。并且本手术可重复进行。3．羊膜组织的应用：本手术中外层羊膜主要发挥屏障作用，覆盖角膜、结膜创面，缓解刺激症状，避免了瞬目对角膜的干扰，有利于上皮组织的修复。并且形成类似药物缓释装置，可最大限度地发挥药物的作用。内层多层羊膜主要作为胶原基质用于角膜的重建，角膜的重建以往主要用同种异体角膜材料，研究表明羊膜中大量存在I、V、Ⅵ型胶原和糖蛋白(如层粘连蛋白)，可作为胶原基质用于角膜的重建 。本组患者溃疡区的角膜厚度术后2～3个月基本稳定，部分恢复正常，部分较正常薄，但表面大都光滑。本手术采用商品化的冷冻干燥羊膜，使用方便、安全可靠，其组织相容性好，易于l临床推广使用。电镜观察及免疫组化实验表明，在冷冻干燥羊膜中基本分子组成及主要组织结构无明显改变旧。4．手术技巧及注意事项(1)剖切范围及深度适当：既要将溃疡病灶及炎性浸润区彻底切除，又要尽量保留健康的角膜组织。剖切范围应超过溃疡面边缘1 mm，深度以将病变组织基本切除为准，避免造成角膜穿孔。切除角膜缘浅层巩膜一般在2 rain宽左右，长度与角膜剖切长度相等，球结膜(包括结膜下组织)应切除5 mm或更宽，长度稍长于角膜剖切长度。(2)冷冻范围应与切割范围相等：尤其是溃疡进行缘两端更应彻底割冻，不要姑息肉眼看来还“健康”而裂隙灯下已被浸润的组织。冷冻范围以溃疡进行缘两端外1 mm起点为宜，冷冻采用多点、短时，并且针对不同部位灵活选择冷冻参数，以避免术后炎症反应过重、眼压降低等。(3)羊膜覆盖：内层羊膜尽量修剪成与溃疡灶形状、深度类似，充填达前弹力膜表面，与角膜创面仔细、充分地缝合固定，防止羊膜植片滑动，减少植片下间隙。外层羊膜先在角膜缘3、6、9及12点钟位作4针固定，然后挂浅层巩膜后与结膜残端固定，清除羊膜下积血、积液，避免羊膜过早溶解、坏死。术后联合使用CsA滴眼。(5)存在的问题：①蚕蚀性角膜溃疡中国的发病率为0．03％，l临床发病率较低，本研究病例数较少，难以采用随机和盲法l临床试验来评价不同疗法的疗效。②复层羊膜与板层角膜在超微结构、理化功能上是否有差异尚不清楚。③本组病人在增视性方面仍然不十分明显。参考文献l 谢立信，史伟云．角膜病学．第l版，北京：人民卫生出版社，2007：4：316-321．2 Young RD，W atson PG．Light and electron microscopy ofcorneal meh—ing syndrome Mooren's ulcer．Br J Ophthalmol，1982，66：341-356．3 JohnD．Gottseh of autoimmunity to a cornea-associated stromal an tigenin patients with Mooren S ulcer．Investigative Ophthalmology＆ VisualScience，l995，36(6)：l541一l5474 赵京城，金秀英．蚕蚀性角膜溃疡发病机理的探讨．中华眼科杂志，1994，30：4—7．5 陈家祺，谢汉平，龚向明．蚕蚀性角膜溃疡的临床特点分析．中华眼科杂志，1999，35(2)：125—128．6 董莹，谷树严．蚕蚀性角膜溃疡的治疗．中国实用眼科杂志，2005，23：1120-11247 Hanada K，Shimazaki J，Shimmura S，et a1．Muhilayered amniotic membranetransplantation for severe ulceration of the cornea an d sclera．Am J Ophthalmol，2001，13l：324—33l_8 Adds PJ，Hunt CJ，Dart JK．Arrmiotic／ne／l~ra／le grafts，fresh orfrozen?A clinical an d in vivo comparision．Br J Ophthalmol，2001，85：905—907．

上睑下垂手术治疗500例 高明宏 徐旭 于静 禹海 陈颖欣【摘要】 目的 探讨不同种类上睑下垂的手术治疗方法和效果。方法 对500例(620只眼)上睑下垂的手术治疗进行了回顾性总结。上睑下垂的种类包括先天性、神经源性、肌源性、外伤性、机械性和老年性。手术方法包括提上睑肌缩短术、提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术、Whitnall韧带悬吊术、弗．盖氏术、提上睑肌，腱膜修补术和改良Hotz术。结果总体手术成功率为90．3％ (560／620只眼)。疗效不满意的6o只眼中过矫5只，欠矫55只(合并睑畸形4只，睑内翻6只，睑外翻2只)。提上睑肌缩短术治疗轻、中度先天性上睑下垂的手术成功率为93．8％ 。提上睑肌缩短术和提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术治疗重度先天性上睑下垂的手术成功率分别为72．4％ 和100％ 。WhitnaU韧带悬吊术治疗复发性先天性上睑下垂的手术成功率为90％ 。弗．盖氏术、WhitnaU韧带悬吊术和提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术治疗神经源性和肌源性上睑下垂的手术成功率分别为41．6％ 、80％ 和90％ 。提上睑肌，腱膜修补术治疗外伤性和老年性上睑下垂的手术成功率分别为94．7％ 和100％ 。改良Hotz术治疗机械性上睑下垂的手术成功率为93．3％ 。结论 根据上睑下垂的种类和程度选择适宜的手术方法和完善手术技巧是提高手术成功率的关键。【关键词】上睑下垂SIIr．gical management of blepharoptosis：a report of 500 P．II~S GAO Ming-hong，XU Xu， U Jing，YUHai，CHEN Ying-xin．The General Hospital ofShenvang Military Command，Shenyang 110016，China【Abstract】Objective To investigate the various surgical techniques and their results for diferent typesof blepharoptosis．M ethods 620 eyes of 500 cases with blepharoptosis who underwent surgical treatment wereretrospectively analyzed．The patients were diagnosed as congenital，neurogenic，myogenic，traumatic．senile andmechanical ptosis．The used techniques included resection of levator muscle，anastomosis of front'dis muscle andlevator aponeurosis，Whitnall’S ligament sling，Fridenwald—Guyton’S frontalis muscle fixation，levator apoeurosisreconstruction，modified Hotz’S tarsectomy．Results The overa~Success rate was 90．3％ (560／620)．60 eyeswith unsatisfactory result showed overcorrection in 5 eyes and undercorrection in 55 eyes in which the patients alsosufered from combined eyelid deformities in 4 eyes，entropion in 6 eyes and ectropion in 2 eyes．The Success rateof resection of levator muscle for the mild and moderate congenital ptosis was 93-8％ ．Th e Success rates ofresection of levator muscle and anastomosis of levator aponeurosis and frontalis muscle for the severe congenitalptosis were 72．4％ and 100％ respectively．Th e success rate of Whitnall’S ligament sling for the recurrentcongenital ptosis was 90％ ．Th e success rates of Fridenwald-Guyton’s frontalis muscle fixation， Whitnall’s作者单位：110016 沈阳，沈阳军区总医院眼科参 考 文 献1 Catowitz JA． Frontalis suspension in congenital ptosis using apoly~lament． cable—type suture． Arch Ophthalmol， 1979， 97：1659一l663．2 Loft l-IJ，Wobig JL，Dailey RA．Transconjunetival frontalis suspension：a elinnieal evaluation．Ophthalmic Plast Reconstr Surg， 1999， 15：349—354．3 Song R，Song Y．Treatment of blepharoptosis： direct transplantation ofthe frontalis muscle to the upper eyelid．Clin Plast Surg， 1982，9：45．4 Zhou LY，Chang TS．Frontalismyofascial flapfrom eyebrow regionforthecorrection of ptosis of the uppe r eyelid．Eur J Plast Surg，1988，11：73．5 林茂昌主编．现代眼部整形美容学．西安：世界图书出版公司，1997．244．276．6 Ramirez OM ，Pena G． Frontalis muscle advancement： a dynamicstructure for the treatment of severe congenital eyelid ptosis． PlastRec onstr Surg，2004，113：1841—1851．7 王标，刘立本，陈明锐，等．减张法在额肌瓣转移治疗重度上睑下垂中的应用．中华医学美容杂志，2001，7：22．24．中华整形外科杂志2007年9月第23卷第5期Chin J Hast Surg，Sep．2007 Vo1．23 No．5ligament sling and anastomosis of levator apo neurosis and fmntalis muscle for the neurogenic and myogenic ptosisWaS 41．6％ ．80％ and 90％ repectively．The success rates of levator apo eumsis reconstruction for the traumaticand senile ptosis were 94．7％ and 100％ ．respectively．The success rate of modified Hotz’tarsectomy for themechanical ptosis was 93．3％ ．Conclusions The key point for successful correction of ptosis is the selection ofthe right indication for each technique depended on the type an d severity of the ptosis．The techniqu e skill is alsovery impo rtant．【Key words】Blephamptosis真性上睑下垂按病因分为先天性和后天性两大类，后者又分为神经源性、肌源性、外伤性、机械性和老年性 。根据上睑下垂的种类和程度选择适宜的手术方法是保证手术成功的关键。我们自1989年8月至2004年8月15年来共收治各类上睑下垂500例(620只眼)，分别采用6种手术方法，取得了较好的疗效。1 对象与方法1．1 l临床资料500例(620只眼)，男350例(420只眼)，女150例(200只眼)；年龄4～70岁，平均20．5岁。先天性520 只眼，其中轻、中度340只，重度100只，复发性80只；神经源性(动眼神经麻痹)15只眼；肌源性22只眼，其中重症肌无力性18只，进行性眼外肌麻痹4只；外伤性38只眼，其中上睑切割伤10只，钝挫伤8只，异物伤2只，眶肿瘤手术损伤15只，眼睑手术损伤3只；机械性(重症沙眼)15只眼；老年性10只眼。1．2 术式选择轻、中度先天性上睑下垂(提上睑肌肌力>4mm)采用提上睑肌缩短术，重度者(提上睑肌肌力≤4 lain)先后采用了提上睑肌缩短术和提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术，术后复发病例采用Whitnall韧带悬吊术。外伤性上睑下垂采用提上睑肌／腱膜修补术，其中外伤性病例根据病情和病程选择伤后1周内一期手术或伤后3个月二期手术。老年性上睑下垂采用提上睑肌腱膜修补术。对于经过药物系统治疗无效的神经源性、肌源性和机械性上睑下垂，在本人要求手术治疗的前提下，先后采用弗一盖氏术、Whitnall韧带悬吊术和提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术。机械性采用改良Hotz术。1．3 手术方法1．3．1 提上睑肌缩短术均采用内外切口结合法。按重睑设计方法用亚甲蓝画标记线。先翻转上睑，于上睑穹窿部结膜与苗勒肌、提上睑肌腱膜之间注射2％利多卡因少许，进行“液体分离”。在颞侧做一垂直小切口，将直剪刀从切口伸人，在结膜和提上睑肌腱膜之间进行钝性分离。再以加肾上腺素的2％利多卡因2 rnl行上睑皮下和肌层浸润麻醉。在重睑标记线上下以0号丝线各作一皮肤牵引线。沿画线切开皮肤、皮下和眼轮匝肌，显露睑板。将睑板前和上缘的提上睑肌腱膜纤维进行切断游离，直至显露出睑板上方的结膜。钝性分离提上睑肌腱膜与眼轮匝肌之间的疏松粘连，显露出Whitnall韧带。以L形眼肌镊子夹住已经游离的提上睑肌腱膜断端，于提上睑肌腱膜与结膜之间行提上睑肌腱膜下面的分离，其方法是分别牵拉睑板和提上睑肌腱膜瓣，形成张力性夹角，使提上睑肌腱膜纤维柬清晰可见，再做锐性分离，分离高度依缩短量而定。适度剪开提上睑肌腱膜瓣的两个侧角，但注意避免完全剪开Whitnall韧带内外附着点，以防韧带松弛塌陷。用5-0无损伤针线穿过睑板中部3针，其位置分布要均匀。根据预计缩短量将3针缝线分别从提上睑肌腱膜的相应位置引出(重度者从Whitnall韧带上方引出)，形成3对褥式缝线。先打活结，观察上睑缘位置和弧度，效果不满意时可先调整缝线的松紧度，必要时重新调整缝合位置，满意后结扎，并剪除缩短的提上睑肌。对眶隔已开放者行眶隔修补术。去除睑板前一条眼轮匝肌，于原位作皮肤切口的对位缝合，其中至少4针要带睑板和肌肉残端。对于提上睑肌分离范围过大者，可行穹窿结膜的固定缝合以防术后穹窿结膜脱垂。最后在下睑中央近睑缘处做一褥式牵引线(Frost线)，涂眼膏于结膜囊后拉紧该线，闭合眼睑。加压包扎3～4 d，每天更换敷料。术后全身应用抗生素、止血药等。4 d拆除穹窿结膜的固定缝合线，7 d拆除切口缝线和Frost线。根据术后眼睑闭合不全程度给予相应处置，如结膜囊涂大量眼膏和配戴湿房性眼罩。1．3．2 提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术(提一额吻合术) 见参考文献[2]。1．3．3 Whitnall韧带悬吊术(上横韧带徙前术) 见中华整形外科杂志2007年9月第23卷第5期 Chin J Plast Sum，Sep．2007 Vo1．23 N0．530只，欠矫8只(合并睑内翻2只)。42只眼行提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术，其中<12岁22只眼，≥l2岁20只眼，术后全部正矫(图1)。2．4 复发性先天性上睑下垂疗效80只眼行Whitnall韧带悬吊术，术后正矫72只，过矫2只，欠矫6只(合并睑畸形2只，图2)。2．5 神经源性和肌源性上睑下垂疗效采用弗一盖氏术l2只眼，正矫5只，欠矫7只：采用韧带悬吊术l5只眼，正矫l2只，欠矫3只；采用提一额吻合术l0只眼，正矫9只，欠矫1只。2．6 外伤性和老年性上睑下垂疗效外伤性38只眼行提上睑肌，腱膜修补术，术后正矫36只，欠矫3只。老年性l0只眼行提上睑肌腱膜修补术，术后全部正矫(图4)。2．7 机械性(重症沙眼)疗效l5只眼行改良Hotz术，术后正矫l4只眼，欠矫1只眼3 讨论上睑下垂其手术治疗方法较多，这是因为该病的种类繁多，而且每种手术方法都不是尽善尽美。因此，要求根据上睑下垂种类不同和程度差异选择适宜的术式。提上睑肌缩短术是治疗轻、中度先天性上睑下垂的有效术式，对于Whitnall韧带发育尚好的重度下垂也可以获得较好的疗效，但对于提上睑肌整体均发育很差的病例，尤其是儿童，术后往往出现欠矫或复发，因此利用额肌来治疗重度先天性上睑下垂已被公认是首选的方法 。迄今，利用额肌的手术方法很多，从经典的弗一盖氏术到近年的提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术，手术方法有了长足的改进。弗一盖氏术(包括后来的改良弗一盖氏术)因为存在术后欠矫率、复发率较高和眼睑运动缺陷等缺点，很难获得理想的远期疗效 。治疗中，重度先天性上睑下垂的术式包括额肌瓣转移术、提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术和Whitnall韧带悬吊术 ，前两种方法对于单侧和双侧上睑下垂均适用，而Whitnall韧带悬吊术非常适合于单侧上睑下垂" 。额肌瓣转移术存在术中额肌剥离范围大、出血多和眼睑臃肿外观等缺点，而提上睑肌腱膜瓣．额肌吻合术恰好克服了这些缺点，并充分发挥了两种术式的优点，既利用了额肌的动力作用，又保证提上睑肌在缩短的同时不改变其在睑板上的正常附着点，更加符合生理，是治疗重度上睑下垂较为理想的方法 ]。我们的体会是，对于重度先天性上睑下垂，应首选提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术，尤其对儿童重度上睑下垂更为合适。至于复发病例，Whitnall韧带悬吊术具有一定优势，因为复发病例的局部解剖结构已经紊乱，并有瘢痕组织增生，再次分离提上睑肌的难度较大，疗效预计性较差，而Whitnall韧带悬吊术操作相对简便，可控性强，可重复性强，术后反应轻。对于病情已经稳定的重症肌无力性和动眼神经麻痹性上睑下垂，弗一盖氏术虽然远期疗效较差(复发率高)，但由于具有操作简便、恢复较快、术后反应轻和可反复多次手术等优点，容易被患者接受，而Whitnall韧带悬吊术和提上睑肌腱膜瓣一额肌吻合术适合于在疗效和美容上要求较高的患者。老年性上睑下垂为腱膜性上睑下垂，多为双眼自发性退行性改变，除上睑下垂外往往同时伴有上睑薄弱、上眶内陷及上睑皱襞上移 。提上睑肌腱膜修补术能使腱膜的病理改变得到解剖复位，同时也使上眶区凹陷畸形得到矫正，因此能获得较好的疗效。参 考 文 献1 林茂昌主编．现代眼部整形美容学．西安：世界图书出版公司。1997．245—246．2 高明宏，蓝平，于静，等．重度儿童先天性上睑下垂的早期手术治疗．中国实用眼科杂志，2005，23：185．186．3 高明宏，李宝储，蓝平，等．Whitnall韧带悬吊术治疗复发先天性上睑下垂．中国实用眼科杂志。1994，12：559—560．4 高建鲁，张式琼．改良Hotz手术同时矫正上睑内翻及沙眼性上睑下垂．眼外伤职业眼病杂志，1998，加：109．5 陈淑端，叶克菁，欧阳和木，等．改良弗一盖氏手术矫正儿童先天性上睑下垂．福建医科大学学报，1998，32：99．6 范巨峰，岳纪良．先天性上睑下垂的基础研究与手术矫治进展．中华整形外科杂志，2003，19：223—225．7 Anderson RL，Jordan DR，Dutton JJ．Whitnall’S sling for poor functionptosis．Arch Ophthamol，1990，108：1628—1632．8 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超低温(一196℃)保存角膜缘上皮细胞生物活性研究 高明宏 张劲松 蓝平【摘要】 目的探讨不同的低温冷冻条件对角膜缘上皮细胞生物活性的影响。方法采用不同浓度梯度的二甲基亚砜和不同的降温速率保存兔角膜缘上皮组织，以台盼蓝染色方法计数角膜缘表层上皮细胞的存活率·通过体外细胞培养方法观察低温保存的角膜缘上皮细胞生长情况，并采用若丹明B染色法对原代细胞的增殖能力进行定量测定，将低温保存带有角膜缘的角膜进行器官培养，采用SABC免疫组织化学染色法检测角膜缘上皮细胞的PCNA表达。结果二甲基亚砜浓度梯度对低温保存的角膜缘表层上皮细胞存活率有显著影响，程序降温的效果明显优于非程序降温。体外细胞培养显示，二甲基亚砜浓度梯度和降温方法对角膜缘上皮细胞增殖能力无显著性影响(P>0．05)，血清培养组优于无血清培养组(P<0．05，P<0．01)。器官培养l周时，低温保存的角膜缘上皮细胞核中均可见PCNA表达，染色阳性细胞主要在基底细胞层。结论角膜缘干细胞具有较强血清依赖性和低温耐受陛，提示超低温保存角膜缘上皮具有可行性。【关键词】 角膜缘上皮细胞， 低温保存， 细胞培养， PCNAViability of the rabbits’corneal limbal epithelial cells cryopreserved at-196℃ GAO Ming·hong，ZHANG 3in-songLANPing．DepartmentofOphthalmology．The1stClinicalHospita1．ChinaMedicalUniversity．Shenyang l10001，China[Abstract] Objective To investigate the influence of diferent cryopreservative conditions on theviability of the rabbits’corneal limbal epithelial cells．Methods Diferent concentration gradients of thedimethylsulfoxid(DMSO)and freezing rates were used to preserve the rabbits’corneal epithelia at-19&C．Thelimbal superficial epithelial cells surviving rates(SESR)were count~ by typan blue staining．Th e growth capacityof the limbal epithelial cells was observed by cell culture and quantitated by Rhodamine B staining．PCNAexpress was determined by immune histochemistry one week in organ culture．Results Th e concentrationgradients had significant influence on the SESR．Th e better results were gained in rate freezing group than innon·ratefreezinggroup．Th egrowthcapacityof thelimbal epithelialcellswere notsensitiveto theconcentrationgradients of DMSO and freezing methods in cell culture(P>0．05)．Th e growth capacity of the cells in serummedia Was higher than that in serum-free media(P<0．052<O．01)．Th e PCNA express Was observed in limbalepithelial cells(mainly in basal layer)one week in organ culture．Conclusion Th e rabbits’corneal limbal stemcells were strongly reliable to the sera and tolerable to the low tempe rature which reveal the corneal limbalepithelia might be suitable to cryopreservation．[Key wordsl Corneal limbal epithelial cells； Cryopreservation； Cell culture； PNCA角膜超低温保存的关键是角膜内皮细胞的活性【-· ，但低温保存对角膜上皮细胞的影响如何?迄今尚无文献报道。基于角膜缘干细胞的新概念，角膜上皮细胞的维持取决于角膜缘干细胞的活性。通信作者：高明宏· 实验研究·此探讨角膜缘上皮细胞低温学特性的意义旨在探讨超低温保存技术长期保存角膜缘干组织／角膜缘干细胞的可行性，从而为眼表重建手术提供更广阔的材料来源，最大程度地利用眼库材料。细胞的增殖和分化是细胞生物活性的两个方面，本研究探讨的问题是超低温保存对角膜缘上皮细胞增殖情况的影响。对此，将从细胞学水平(细胞培养)和组织学水平(器官培养)进行综合性评价，并采用台盼蓝染色方法和细胞培养后若丹明B染色方法分别评价角膜表层上皮细胞和基底层细胞低温保存后的细胞生物活性。现将结果报道如下。材料与方法一实验材料1．动物：选用2kg～3kg新西兰雄性白兔。兔耳缘静脉注入空气栓塞致死后立即摘除眼球，4℃湿房保存<3h。按无菌操作剪下带有角膜缘组织的角膜。2．降温设备和材料程序降温仪(Cryo-med，美国)，恒温冰箱(海尔，青岛)，二甲基亚砜(dimethylsulfoxid，DMSO，Sigma)，人血清白蛋白(human serum albumin，HSA，瑞典)。3．细胞和器官培养材料MEM、DMEM、RPMI一1640和DMEM—F12一Ham营养液(Gibco)l胎牛血清、牛血清白蛋白、Hepes、胰岛素、人转铁蛋白、氢化可的松、台盼蓝、若丹明B(邦定公司)；小鼠3T3细(中国医科大学细胞生物教研室)；小鼠腹腔巨噬细胞(沈阳军区总医院医学实验科惠赠)l二氧化碳培养箱(Heraers，德国)1分光光度仪(美国PE公司)，5cm培养皿和24孔板(邦定公司)。4．免疫组化试剂：SABC试剂盒及鼠抗兔增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。二、降温冷冻保存方法材料制取后，立即浸入预冷的冷冻保护剂(cryoprotectivemedium，CPM)中，按照预定的设计和步骤进行冷平衡和降温冷冻，最后放入液氮罐中标记贮存。CPM的配制方法、降温和复温方法参见既往报道三、台盼蓝染色方法将复温后带有角膜缘的角膜片上皮面朝上置于载玻片上，以0．25％台盼蓝溶液染色lmin，在光镜下连续观察5个视野，取平均值，计数表层上皮细胞的存活率(superficial epithelial survival rate，SESR)，细胞核染为蓝色者为损伤或死亡细胞，SESR数据(P)经反正弦函数转换(x=arc sinp)，做t检验统计学处理。四、细胞培养方法1．无血清培养法：去除角膜缘的固有层组织，剪碎，Hank’S液冲洗两遍，以0．125％胰蛋白酶和0．02％EDTA (1：1)消化15min，Hank’S液漂洗，离心(1O00rpm／min)lOmin。将消化的上皮细胞用培养液稀释为细胞悬液，与丝裂霉素C预处理的3T3细胞悬液或小鼠腹腔巨噬细胞一起接种于24孔板的无血清培养基(DMEM—F12一Ham营养液加入5pg／ml胰岛素、5pg／ml转铁蛋白、0．4~tg／ml氢化可的松、24．3mg／1的腺嘌呤和1 0ng／mlEGF)中。上皮细胞和3T3细胞(或巨噬细胞)的接种浓度分别为3×10 细胞／cm 和2×10 细胞／cm 。在二氧化碳浓度为5％、37℃的孵箱中培养。第一天的培养基中加入10％的胎牛血清，第二天用l Omg／ml的牛血清白蛋白代替胎牛血清加入培养基中，继续孵育。每天在倒置显微镜(o1ympus日本)下观察和记录每孔细胞生长特点。一周换液2次。2．血清培养方法(1)组织块培养法：把每块材料剪成3块2mm×3mm大小的组织块，上皮面朝了放入24孔板中，每孔中分别加入MEM、DMEM．RPMI-1640营养液，同时加入20％胎牛血清。营养液以刚浸没标本为庞第2天每孔再补加相同适量的培养液。在37℃、空气浓度为95％、二氧化碳浓度为5％的条件下孵育。(2)消化培养法：消化方法同无血清培养方法。消化后以3×10 细胞／cm 密度接种于24孔板中。同样分别加入MEM、DMEM、RPMI-1640营养液和20％胎牛血清。培养条件同组织块方法。3．细胞增殖实验．采用改良的若丹明B染色方法【4]。在细胞的指数生期，将每孔用10％甲醛磷酸缓冲液固定2h，再用蒸馏水冲洗2次。用2％(Ⅵ ／vo1)若丹明B溶液染色30min。然后用0．2N的盐酸彻底冲洗，并在室温下干燥5小时以除去孔中残余液体。之后每孔中加入Iml0．2N的NaOH，在室温孵育1 0min。收集每孔的液体。应用分光光度仪测定吸收峰为550nm的吸光度(ABS值)。五、器官培养方法将带有角膜缘上皮的完整角膜置于5mm直径的培养皿中，上皮面朝上。加入含1 5％胎牛血清、4mM谷氨酰胺、25mM Hepes和50~g／ml硫酸庆大霉素的DMEM保存液。在34～35"C、5％CO，二氧化碳培养箱中孵育。隔日换液。六、免疫组织化学染色器官培养1周时，将材料甲醛固定，按说明书流程操作制作切片，采用HE染色进行角膜缘部定位，SABC法进行PCNA染色。结果判定方法：胞q 科帑 211(16午^H 24 锥 c '』F Tw l lf1I1H1w P ’III1 2ln，V d J1 24．、u 6梧内染色 柠黄色为PCNA染色 J主。此镜 对每张角膜缘L应fl<#ll-~,q 片随机选择4 商倍视野计算染包l：1一 细胞占细咆证教的 均}!=『分比，擐后计算l0份标啦的半均l；门性细胞率 PCNA染色 日率果用t检验制 。结 果低温保存对角骥缘丧层上应活性的影响1．DMSO浓度梯嚏对角缘表层上皮活 I：的影响：存车¨ 降湍条件r，DMSO浓度选用4种梯度【A绀)的赦米最佳． SESR与且它4组有显 性荤异cp<[】．01)。无冷冻保护 刊组(E组)敬粜昂=4耋2．降温速率对角 绿丧层上皮活眭n目影晦庄相同CPM 条件下．程咩降温(A B．C组) 非程序降温(【)组)比较．角膜缘表层上崖到胞的SESR差异有撮蒋 (P<0(1I) 1 0c tnilI，5( nzi L1、1【l 0c 111 的降愠速率对角『俺缘丧层上皮细胞SESR 无影响(P>0 [15)(丧2)。2)．不能传代； 无冷冻保护刺、非崔序降温帕细胞f无论是何种培养方法)贴辈后，其形恋多样，九小1一很快衰警 脱落，小能膨成单甚结构c 3)。低温保仔角Ⅱ瞳绿上皮原代细胞墙养特rl 细咆生I乇4芋一鼍：采用冷冻保护剂址理 程序降温 组织块法血清培养的细胞蚺肇后．其形态与新鲜 料的细胞相似+旱大小一致曲多也 ．于接种后7～【0灭达到 合状态．形成排列巢督的』堪 № 日3单甚细胞(罔1)．可传{代；采H{f母冻保护剁处理 2．细胞增殖定量蛮验(若 叫B 邑)(圈4)：消化法无_仉清培养的细胞【 沦星采用程宇或 F程 (1)DMSO浓度梯度对角膜缘上皮细胞增l硝的影序降温)贴壁后，其形态出班变异．呈 条形相I短 响：采片j 4种(A纰)和1种(B纽)浓度DMSO冷梭形，1=接种后10—14无形成松散的单层细胞(图 冻保存的角膜缘上皮自Ⅱ胞．在无向清培养和血清培目养条件 ，细胞增殖能力(A值)差异无显菩性(P>0 05)；忸一组与无DMSO鲥(C组)比较，差异显著(P<0．00I) 住尢血清墒养组中，以3T3细胞为滋养层， 胞增靖能力(A值)与臣噬细胞相似(P>0 05) 拄血清墙养组．以1640埔养基n々细胞增殖能 J最强， MEM组和DMEM 组比较．其A值差异鼎著(P<O．05) 在相同的玲冻条件下，Ⅲ清培斧组织增贿能打(A值)显著高于无血清培养组(P<0 05，P<0．0I)(2)降温谜率对角膜缘}，应细胞增照的影响，比较角8其缘L应细胞存功札清皆捧币I鲫青培养条什下，细胞增墒能l力(A值)差 厄显耸性【P>0 05)。(3)冷冻组织与新鲜组织角膜缘上皮细胞增殖能力的比较冷冻组织 新鲜组织比较．在Ⅱ】l清培养条件下．两组的细胞增殖能力差异无显营性【P>0 05)；但在无血清培养基中，冷诛圭址织的细胞增殖能 明显低于新鲜组，细胞增殖能加，器官培养中角膜缘上皮细胞PCNA表达角膜缘上皮细胞核中均 PCNA表达 染色呈棕黄色或椋褐色．染色m性细胞主要在塾底细胞层。讨 论低'品与角目弗绿上皮细胞超低温。超低温冷藏：保存的最九难题妊悍持纽『胞内结构完 ，冷冻一解融过程会给谋存n々细眦带求 定化学和物理上酌损f打，选择适宜的冷冻保护瀚和降温迪率是冷酥保存的关键技术。冷垛保护制在冷陈复温过程一lt能缓解细胞渗透压的 化，使蒲质形成“l艇璃化’．防止I水晶形成 角膜的垛存土要是针对内皮层．而角膜内应层屉一单屠细胞．上皮层则有由复层上皮中国实用眼科杂志2006年6月第24卷第6期Chin JPractOphthalmol，June 20o6，Vol24，No．6细胞构成，因此上皮层的保存更要求冷冻保护剂要具有较好的膜通透性和渗透快特点。DMSO就具备这些特点，对角膜缘上皮组织的保存来说较适合。从理论上讲，保护剂的浓高较高，渗透越快。但是，DMSO具有一定细胞毒性，终浓度一般不能超l0％(w／v)，因此通常选择“梯度稀释法”。对于降温速度，从理论上讲，将标本瞬间降温至一80℃以下，能预防冰晶的形成，但现实中难以实现。因此，目前还是采用缓慢速率(程序)降温的方法。本文研究结果显示，对于角膜缘表层上皮细胞，DMso的浓度梯度越小，细胞活性越高，直接移人液氮的效果明显劣于速率降温，说明角膜缘表层上皮细胞的冷冻保存条件要求很高。而对于角膜缘原代培养的上皮细胞，DMSO的浓度梯度和降温方法对其增殖均没有显著影响。其原因就在于角膜缘上皮组织的特殊性，即角膜干细胞定位于该部位的基底细胞层。目前角膜缘干细胞还没有公认的特异性免疫标志，但有研究表明【 ，角膜缘上皮的原代培养细胞K 角质蛋白染色基本阴性，表明原代细胞是处于未分化状态的原始细胞，具有干细胞的基本生物学特性，因此原代细胞目前被看作是角膜干细胞。由于干细胞的共性是慢反应细胞，细胞周期长，细胞浆少，因此这些可能是其对冷冻损伤耐受性较强的原因；又因其具有极大增殖潜力，在角膜上皮损伤时通过不对称的细胞分裂转化为过度性放大细胞，并很快分化为有丝分裂细胞。而角膜缘表层上皮细胞是分化终末细胞，对冷冻损伤的耐受性相对较差。本文结果揭示，角膜缘干细胞具有较强的低温耐受性。二、血清与角膜缘上皮细胞本文结果显示，冷冻角膜缘上皮在血清培养基中生长状态较无血清培养基好。这与角膜缘干细胞增殖条件有关。Ebato等【6】在对角膜周边上皮和角膜和中央上皮的体外培养研究中发现，周边上皮细胞在无血清培养条件下增殖能力低于中央上皮细胞，而在含血清的培养基中，结果相反。Kruse等[7】的研究结果亦证实，角膜缘上皮细胞的增殖能力受血清的影响，具有血清浓度依赖性。但血清中也含有对细胞有害的物质和生长抑制因子。故血清的添加浓度一般不超过20％。本研究结果与上述报道相一致，进一步提示角膜缘部存在受血清因素调节的干细胞。本研究证实，低温保存的角膜缘上皮细胞在细胞增殖能力上并不比新鲜材料低，而且器官培养中通过PCNA的表达情况，可以展示了超低温冷冻保存角膜缘上皮细胞的可行性及其材料用于眼表重建的可能性。参考文献l 王传富，鞠明诚，石珍荣，等．深低温长期保存角膜穿透性移植的研究．中华眼科杂志，1990，26：l7～l92 蓝平，高明宏，孟彤柏，等．长期低温保存角膜方法的建立和临床应用．中国实用眼科杂志，2001，19：l35～1373 高明宏，蓝平，陈伟，等．简化四步法低温保存角膜的实验研究．中国实用眼科杂志，2000，l8：359～3604 Castro··Munozledo F,Valencia-Garcia C,Kufi··Harcuch W．Cultivationof rabbit corneal epithelial cells in serum—free medium．InvestOphthalmol Vis Sci．199738：223 也2445 崔彦，董晓光，谢立信，等．人角膜缘干细胞的原代培养和生物学鉴别．眼科经纬，1998，3：75～786 Ebato B,Friend J,Thoft RA．Comparison ofcentral and peripheral hu．man comeal epithelium in tissue culture．Invest Ophthalmol Vis Sci，198728：1450~14567 Kruse FE,Tseng SC．A serum．free clonal growth assay for limbal，peripheral,and central corneal epithelium．Invest Ophthalmol Vis Sci，199l,32：2086-2095

蓝平 高明宏 范忠义 徐旭 于静 禹海 肖卉 陈颖欣沈阳军区总医院眼科目的：探讨小梁切除术联合丝裂霉素C治疗难治性青光眼的效果。方法：采用小梁切除术联合术中应用丝裂霉素C，对34例(47眼)难治性青光眼进行了手术治疗；术后进行了1年的随访。结果：术后前房均形成良好。术后1年随访， I型滤过泡27眼， Ⅱ型19眼，Ⅲ型1眼。术后1周、1个月、6个月、1年的平均眼压值分别为10．23±6．41、12．43±7．62、16．03±6．19、18．55±5．95mmHg。视力增进28眼，无变化19眼。结论：小梁切除术联合丝裂霉素C是治疗难治性青光眼的有效方法。关键词：小梁切除术丝裂霉素青光眼 ．Trabeculectomy with mitomycin C for refractory glaucomaLan Ping，Gao M inghong ， Fan zhong yi，et alDepartment(1；Ophthalmology，The General Hospital ofShenyangMilitaryCommand，Shenyang 110015，ChinaObjective：To investigate the effect of trabeculectomy with mitomycin C in refractory glaucoma．Methods：The trabeculectomy with mitomycin C and 1 year follow up were run in 34 eases(47 eyes)of refractory glaucoma．Results：The anterior chambers were well formed．Type I filtering cysts were found in 27 eyes，type 1I in 19 eyes，type Ill 1 eyes．Theacuity was promoted in 28 eyes， unpromopted 19 eyes．Conclusions：The trabeculectomy with mitomycin C is effective in refractory glaucoma．Key words：Tratx．'culectomy，mitomycin，glaucoma 青光眼滤过手术失败主要原因是球结膜下成纤维细胞过度增殖，致滤过泡下瘢痕形成，重新阻断滤过道的作用。我们以小梁切除术联合术中应用丝裂霉素C(MMC)，明显提高了难治性青光眼手术成功率。临床资料与方法1．一般资料：对1996年1月～2001年1月的34例(47眼)难治性青光眼的临床资料，进行回顾性分析。其中男性19例，女性l5例；双眼l3例，右眼17例，左眼4例。平均年龄为56(7～80)岁。2．术前诊断：滤过性手术失败的慢性闭角型青光眼20眼、急性闭角型青光眼10眼、慢性开角型青光眼8眼，青少年型青光眼3眼，先天性青光眼2眼，新生血管性青光眼2眼，葡萄膜炎继发性青光眼2眼，其中有28眼为2次手术以上。3．手术方法：手术前先做房角镜检查，确定手术适宜部位，再在局麻下行常规小粱切除术。做以角膜缘为基底部的结膜瓣和4×5mm巩膜瓣。将约4×4mm 大小粘有0．4％丝裂霉素液的小棉片，放置巩膜瓣和球结膜下4～5分钟后，用生理盐水反复冲洗创面和结膜囊，掀开巩膜瓣，于瓣下角巩膜缘处切除1×2mm小梁组织，相应虹膜根部做周边切除，点肾上腺素止血，平复巩膜瓣，将巩膜瓣两端缝合固定浅层巩膜组织上，点1％阿托品眼液散瞳，连续缝合球结膜，半球后注射庆大霉素2万u和地塞米松2．5rag，单眼包扎回病房。术后每天换药，全身用抗生素和皮质类固醇激素，第6天拆除结膜缝线。第6天测视力及眼压，术后随访。结 果1．术后前房形成情况：前房均在术后第1天开始形成，第2天前房深度恢复正常5眼，第3天14眼，第4天18眼，第5天9眼，第10天1眼。2．滤枕形态：术后第1天，所有病例均有滤枕形成。术后1年随访，I型微囊样结膜滤过泡27眼，Ⅱ型弥漫性滤过泡19眼，Ⅲ型非功能滤过泡1眼。3．眼压：术后1周、1月、6月、1年的平均眼压分别为10．23±6．41、12．43±7．62、16．03±6．19、18．55±5．95mmHg。术后半个月眼压由14．57升至24．38mmI-Ig 1眼，经眼球按摩治疗，眼压逐渐控制在15．88mmI-Ig左右。新生血管性青光眼术后6个月，前房出血引起眼压升高至42．12mmI-Ig，保守治疗。4．视力：较术前提高2行10眼，提高3～4行以上8眼，无变化19眼。中国实用眼科杂志第20卷(2002)第12期5．术后并发症：所有病例均未发生与应用MMC有关的结膜瘘、角膜损害等手术并发症。讨 论 青少年性青光眼、新生血管性青光眼、一次或多次滤过性手术失败的青光眼、无晶体性青光眼等，均属临床难治性青光眼。文献报道，既往滤过性手术失败的青光眼再次手术，60％的病例可能失败。青光眼滤过性手术目的是建立房水向眼外引流新途径，即在巩膜与Tenon S囊、结膜之间形成一个贮水池，吸引房水至眼外引流而降低眼压。成纤维细胞由结膜下组织和表层巩膜组织衍生而来，它的增殖和移行在青光眼滤过手术后伤口愈合过程中起主要作用。青光眼手术后由于血一房水屏障的破坏以及手术区的炎症反应，成纤维细胞大量增殖，导致滤过泡瘢痕形成，这是滤过手术失败的最常见和主要的原因。青光暇滤过手术辅助抗代谢药物治疗难治性青光眼具有一定疗效，已得到国内外眼科学者认可。目前国内外研究较多的抗瘢痕形成药物有抗代谢药物、胶原纤维交叉联接抑制剂、组织型纤维酶原激活剂、皮质类固醇等。在这些药中，已经得到公认并用于临床的是丝裂霉素c和5一FuE2~4】。丝裂霉素c是由头状链霉菌产生乙撑亚胺类抗生素混合物中的一种成分，具有烷化作用，与DNA分子的双螺旋形成交联，破坏DNA的结构和功能，抑制增殖期细胞的DNA复制，并能抑制RNA依赖性DNA 合成，从而有效地抑制成纤维细胞的增殖 j，对增殖各期及静止期细胞均有抑制作用，能直接减少滤过口瘢痕形成 j。使用方法多采用术中首都医科大学顺义校区101300制作板层巩膜瓣后用浸有0．2～0．5mg／ml棉片置于巩膜瓣下5分钟，去棉片后用生理盐水充分冲洗，清除残留的丝裂霉素c药液。不同浓度的丝裂霉素c对成纤维细胞抑制作用不同。同一浓度作用时间不同，其抑制作用也不同。我们对难治性青光眼采用0．4mg／ml持续接触组织5分钟。丝裂霉素C和所有抗代谢药物一样都有引起并发症发生的可能，如角膜组织浸润、结膜切口不愈合造成伤口渗漏，浅／无前房及脉络膜脱离等，但丝裂霉素角膜并发症较其它抗代谢药少见。本组病例均未发生明显与MMC有关的手术并发症，这与术中和术后合理处理有直接关系。我们的体会是：术中尽可能使MMC不与非手术区接触，小梁切除前彻底冲洗。术野要充分止血，防止MMC浓度稀释和流到其他部位。结膜缝合要紧密，防止结膜缘卷边，以利于结膜伤口愈合。参考文献[1]孙兴怀，褚仁远．难治性青光眼的治疗．国外医学眼科学分册】995 】9： 】6[2]吴玲玲，尹金福．丝裂霉素C在难治性青光眼滤过术中的应用．中华眼科杂志1996 32：32[3]Kup[n TH，Juzy& MS，Shin DH，et a1．Adjunctive mitomycin C inprimary trabeculectomy in phakie ey ．Am J Ophthalmol 1995119：30～39[4]Megevand GS，Salmon JF，Scholth RP，et a1．The effect of duceingthe exposure time of mitomycin C in glaucoma filtering surgery．Oph—thalmology 1995 102：84～90[5]周文炳，李美玉，王净华(主编)．青光眼研究进展．第1版．青岛：青岛海洋出版社1993 235～239[6]Chen CW．Tralmo．dectomy with simultaneous topical apphcation of mito—mycinCinmfmcmyglaumma．JOcularPharmacol 1990 6：175

沈阳军区总医院眼科高明宏 蓝平 孟彤柏 曲静涛 夏国英目的：探讨深低温保存对穿透性角膜移植术后植片厚度和内皮细胞的影响。方法：采用SP一2000非接触式角膜内皮显微镜(Topcon，日本)和角膜内皮分析仪，对26眼冷冻植片的术后植片厚度和内皮细胞变化进行了临床动态观察，并以32眼新鲜植片做对照。结果：术后1个月，冷冻植片组的植片厚度显著大于新鲜植片组(P<0．01)；术后3、6和12个月，两组差异无显著性(P>0．05)。术后1、3、6和12个月，冷冻植片组内皮细胞密度均显著低于新鲜植片组(P<0．05)。术后1和3个月，冷冻植片组内皮细胞丢失率、细胞面积变异系数和六角形细胞比率均与新鲜植片组有显著差异(P<0．01，P<0．05)；术后6和12个月，两组差异无显著性(P>0．05)。结论：深低温冷冻保存的角膜存在一定潜在损伤，移植术后内皮细胞丢失率和形态学改变比新鲜植片显著；植片水肿恢复速度较慢。但术后1年仍然具有维持角膜透明的内皮细胞密度、正常的细胞形态和正常的角膜厚度。关键词：角膜内皮显微镜穿透性角膜移植低温保存Postoperative thickness and the endothelial cells of the cryopreservedgraft applied in pe netrating keratoplastyGaoMinghong，Lan Ping，MengTongbai，Qu Jingtao，XiaGuoyingDepartment ofOphthalmology，TheGeneralHospital ofShenyangMilitaryCommand，Shenyang 110015，ChinaObjective：To investigate the influence of cryopreservation on the thickness and the endothelial cells of the grafts which was used in pene—trating keratoplasty．Methods：The thickness and endothelial cells of 26 cryopreserved grafts and 32 fresh grafts were measured by SP——2000 non——contactedspecular microscope．Results：The thickness of the cryopreserved grafts Was significantly higher than that of the fresh grafts at one month after operation(P<0．01)．But there were no differences between two groups at 3，6 and 12 months after operation(P>0．05)．The densities of the en—dothelial cells of the cryopreserved grafts were lower those that of the fresh ones at 1，3，6 and 12 months after operation(P<0．05)．There were sign ificant differences in the loss rate of endothelial cells，the cell variant coefficient and the hexagonal cell rate between the twogroups(P<0．05)at 1 and 3 months after operation，but no differences at 6 and 12 months after operation(P>O．05)．Conclusions：The latent freeze—thaw iniury results in longer corneal edema．the enough endothelial cells density，however，may ma in—tain the transparency of the cryopreserved grafts．Key words：Cryopreservation，Keratoplasty，Cornea，Endothelial cell有关新鲜1、营养液保存[2-4]和低温保存的角膜材料穿透性移植术后植片厚度或内皮细胞变化，国内外已有报道。但是，其中有关低温保存材料的研究中，缺乏动态观察资料。我们采用具有多点测定功能的新型非接触角膜内皮显微镜SP一2000 (Topcon，日本)及其配套角膜内皮分析仪，对32只新鲜角膜植片和26只低温保存植片的厚度和内皮细胞变化进行了动态观察和分析。材料与方法1．供体材料：于供体死后2h内无菌操作摘除眼球，湿房保存运输。在我院眼库对供体角膜材料进行质量鉴定和筛选。在有受体时于36h内完成移植手术；否则于3h内按“简化四步法”深低温保存角膜片 ]，这种植片大多数情况下用于无新鲜供体材料而又急需角膜移植的病例。对术中残余的供体角膜周边部的内皮细胞用1％台盼蓝染色，计算细胞活性密度，把所测值近似看作为移植前的供体角膜内皮细胞密度。我们筛选了58例(58眼)部分穿透性角膜移中国实用眼科杂志第20卷(2002)第12期植术后植片透明弗能进行连续动态观察的病例。其中采用新鲜供体材料32例，低温保存材料26例。在诊断上，前者包括角膜白斑16例，感染性角膜溃疡11例，大泡性角膜病变5例；后者包括感染性角膜溃疡合并角膜穿孔20例，角膜白斑6例。详细临床资料2．植片厚度和内皮细胞观察方法：分别于术后1、2、6和12个月，用Topcon SP一2000型角膜内皮显微镜(Topcon公司， 日本)对术后透明片的厚度和内皮细胞进行连续观察。内皮细胞测定点为5个，其中1个角膜中央部，其余4个点分别位于旁中央角膜的上方、下方、颞上和鼻上。每点包含1mm角膜内皮区域。将内皮镜显示的图象直接输入计程控的角膜内皮细胞分析仪中，用Image—NET软件对图象进行处理和分析。内皮细胞的参数包括细胞密度(CD，细胞／n1m )、内皮细胞密降率(CL，％)细胞面积变异系数(CV，％)和六角形细胞比率(CH，％)。结 果1．术后植片厚度变化：表2数据代表角膜内皮显微镜测定的中央角膜厚度。术后1个月，冷冻植片组与新鲜植片组比较，数据有显著性差异P<0．01)。而后来的3次观察结果显示了两组间无显著性差异(P>0．05)。表2 术后植片厚度变化(inll1)2．术后植片内皮细胞变化：如材料与方法中所描述，术后每个植片做5个不同部位的角膜内皮分析，我们发现5个测定点的数据之间均无统计学意义(本文中未显示结果)。我们将这5个点所测值的均值作为该植片的终值，表3中数据则由此得出。统计学分析结果显示，术后1年内新鲜植片组和冷冻植片组的平均内皮细胞密度(CD)一直差异显著(P<0．05)。与术前相比，术后1个月时新鲜植片组的平均内皮细胞密度下降25．1％，冷冻植片组下降43．5％；但对于其后的3次观察，两组下降率相似。术后1和3个月时两组比较，内皮细胞面积变异系数(CV)和六角形细胞比率(CH)差异显著(P<0．01，P<0．05)；而在术后6月和12月时无显著性差异(P>0．05)。表3 术后植片内皮细胞变化注：与新鲜植片组比较，#P<0．01； *P<0．05讨 论既往报道【卜 】中， 由于角膜内皮显微镜技术的限制，对活体角膜内皮的观察只能局限于中央部，由此引出争议，即中央角膜的结果能否真映角膜内皮细胞的整体状态。我们采用具有多点测定功能的角膜内皮镜及内皮细胞分析仪对大样本正常国人和本组病例的研究发现，角膜和旁中央的内皮细胞密度及形态学参数均无显著性差异(另文报道)结果肯定了既往研究的价值。从统计学上看，标准差反映数据的精密度。我们将本组测厚数据与既往有关超声角膜测厚的资料进行比较l2'4J，发现本组数据标准差大，表明角膜内皮镜的光学测厚数据不如超声测厚数据精确。但从临床角度上评价，非接触型角膜内皮镜操作简便，不对角膜上皮构成损伤。角膜厚度是反映角膜内皮功能的一项客观指标。本文结果显示，在术后1个月时冷冻植片厚度仍高于新鲜植片，而后者的厚度已基本接近正常。术后3个月时冷冻植片厚度与新鲜植片相仿。说明冷冻植片内皮细胞恢复较新鲜植片慢，临床上表现为术后角膜水肿恢复速度较新鲜植片慢。其原因可能与冷冻一短一解融后内皮细胞存在潜在损伤并需要一定时间来恢复有关。中国实用眼科杂志第20卷(2002)第12期移植前对植片密度进行统计，发现冷冻和新鲜植片间内皮细胞密度相近，无统计学意义(P>0．05)(表1)。但移植术后两组的内皮细胞一直存在较大差异(表3)，这主要是在术后3个月内细胞密度下降率显著不同，即冷冻组内皮细胞丢失率较显著。根据本组资料我们推测其可能有原因两个。一是冷冻保存对植片内皮细胞的损伤；另一个是本研究冷冻组病例的病情较严重，术后反应较大，对内皮细胞的影响可能较大。内皮细胞的形态学分析，术后3个月内，冷冻植片组与新鲜植片组在面积变异系数和六角形细胞比率上均有显著差异，提示冷冻保存对内皮细胞结构的影响。术后3个月以后，冷冻植片组的内皮细胞丢失率和形态学改变基本与新鲜植片组相同。Erdmann L等对 J 17例穿透性角膜移植术后1年和13年的植片进行随访研究，发现植片平均内皮细胞密度分别为1，028细胞／mm 和988细胞／mm ，角膜厚度保持在0．51ram。本文采用“简化四步法”抚顺市眼病医院113"008保存角膜，植片术后1年的情况与上述结果相似，说明可以用“简化法”代替设备昂贵、操作复杂的经典冷冻方法。根据以上资料我们推论，冷冻一解融使角膜内皮细胞存在潜在损伤，使其对手术创伤和术后眼内反应的抵抗力下降，因此术后细胞的丢失率和形态学变化明显，而最终修复的细胞能够发挥正常的细胞功能，并以足够的细胞密度维持角膜的正常厚度和透明度。参考文献[1]谢立信，康凤英，董晓光等．中华眼科杂志 1988 24：76[2]Bourne wM，Doughman DJ，Lindstrom RL，et a1．Ophthalmology1984 91：285[3]Bourne wM，Lindstrom RL，Doughman DJ．Am J Op hthalmoll985 100：789[4]Geerards AJM，Kok JHC．Cornea 1993 12：277[5]王传富，鞠明诚，石珍荣等．中华眼科杂志1990 6：17[6]Erdmann L，Ehle~N．Acta Op hthalmol 1993 71：703[7]高明宏，蓝平，陈伟等．中国实用眼科杂志2000 l8：350(20H02年7月收稿)