范军华医生的科普号

2009年，一个9岁的四川小女孩，因病毒性角膜炎左眼失明，经精心治疗，视力奇迹般恢复到1.02012年，小女孩12岁，因在四川老家病毒性角膜炎反复发作治疗不及时而再次失明，找到我时角膜瓷白色混浊疤痕，外观让人心碎，视力只有手动/眼前，给予角膜移植手术治疗。之后，一家留在泉州工作。岁月荏冉，一路呵护，当年的小女孩已毕业参加工作，成了大姑娘。2019年的今天，复查左眼视力1.0，比健康的右眼视力还好。祝福你，小姑娘，未来一路阳光！图1 2009年，首次就诊，左眼病毒性角膜炎失明，角膜完全水肿混浊图2 治疗1周后角膜逐渐恢复透明图3 治疗2周后左眼角膜完全透明，视力恢复到1.0图4 2012年，患者左眼因病毒性角膜炎反复发作，在当地未及时有效治疗而再次失明，角膜疤痕混浊，给予穿透性角膜移植手术。图5 2019年，角膜移植术后7年复查，视力1.0，比右眼视力还好图6 角膜植片透明现在已是美丽漂亮的大姑娘！

大面积重型真菌性角膜溃疡，在其它大型眼科医院诊为不进行角膜移植没有治愈希望。这是该患者治疗3周后，角膜溃疡完全愈合，无明显疤痕，最终视力0.8

范军华 李学喜 潘栋平The ultrastructure and clinical application of corneas preserved by long-term cryopreservation with glycerol.Jun-hua Fan, Xue-xi Li, Dong-ping Pan.[Key words] Lamellar keratoplasty; Ultrastructure; low-temperature refrigeration, corneal preservation; glycerol; sodium hyaluronate[Abstract] Objective Research a new method of long-term preservation of the cornea in order to meet the demand of clinical lamellar keratoplasty. Methods The corneas coated with sodium hyaluronate were long-term preserved in -45 ℃ glycerol. after 1 year, 15 cases accepted lamellar keratoplasty with the long-term preserved cornea, and the cornea were taken by transmission electron microscopy examination. Results All surgeries were successful, and patients were followed up for 6 to 24 months. 13 grafts were transparent, 1 graft was translucent, and 1 cases of graft was neovascularization. TEM examination showed that the ultrastructure of cornea was well-preserved. Conclusion The improved long-term cryopreservation with glycerol could preserve some viability of cornea. It is a proper way of preservation that could be used for Lamellar keratoplasty in clinic when there have no fresh corneas.[关键词] 板层角膜移植；超微结构；低温冷冻，角膜保存；甘油；透明质酸钠[摘要] 目的 研究一种新型的长期保存角膜的方法，以满足临床对板层角膜移植的需要。方法 将涂有透明质酸钠（sodium hyaluronate，SH）的角膜片在-45℃以下长期甘油低温冷冻保存，保存1年之后，用于15例板层角膜移植并进行透射电镜检查。结果 15例手术均顺利，术后随访6~24个月，13例植片透明，1例植片呈半透明状，1例植片部分新生血管化。透射电镜检查显示角膜超微结构保存良好。结论 改良后的新型甘油长期冷冻角膜保存方法，保存的角膜具有一定的活性，适合应用板层角膜移植。甘油用作角膜保存已有较长的历史，但传统甘油保存法保存的角膜时间短，且活性差，用于板层角膜移植透明率不高[1、2]，临床应用明显受限。我们对传统的甘油保存法进行了改进，经电镜检查及临床应用，均取得了较好效果。1 材料和方法1.1 供体角膜的保存1.1.1 甘油准备：将药用无水甘油装于125ml磨口广口瓶内，置于140℃电烤箱内消毒2h后置于4℃的冰箱备用。1.1.2 保存方法：对符合眼库医学标准的15个供体新鲜眼球,按照眼库常规无菌处理后，于角膜缘处做穿刺口，排出房水，注入1%透明质酸钠（山东正大福瑞达公司），然后于角膜缘后2mm处完整剪下角膜，于角膜内皮面注满1%透明质酸钠（sodium hyaluronate，SH）上皮面也均匀涂上透明质酸钠。将角膜内皮面向上小心置于准备好的甘油内，然后置于-45℃冰箱内保存。保存时间1至3年不等。1.2 受体情况 7例角膜皮样瘤患者，男5例，女2例，年龄10~18岁；3例边缘性角膜变性穿孔患者，男2例，女1例，年龄25~45岁；5例外伤性角膜深板层缺损，男4例，女1例，年龄20~42岁。1.3 手术方法自-45℃甘油中取出保存角膜片后,立即置于4℃100ml的平衡盐液中，每2分钟轻轻漂洗一次，使粘连的甘油洗去，5min后再转置于另一杯相同液体中，再复水5min。选择大小适当的环钻于植床上对角膜病损区进行钻切打印，尽量将病损区包括于钻切范围内，然后沿钻切出来的印迹剖切去除病损的板层角膜组织。采用这种方法可以制作出边缘光滑平整的不同形状的植床，包括类椭圆形、新月形等。将复温复水后的供体角膜置于切割枕上，根据植床大小选择等于或大于植床直径0.25mm的环钻进行钻切，再于显微镜下对钻切下来的角膜组织根据所需板层厚度进行剖切。将板层角膜植片移植于植床并以10-0线间断缝合。术后处理同常规板层角膜移植。1.4电镜检查将取材后剩下的角膜立即以3%戊二醛固定送透射电镜检查。2 结果2.1术后观察 15例手术均顺利，无术中并发症。术后随访6~24个月，无植片溶解、脱落，13例植片透明，1例植片呈半透明状，1例位于角膜缘的植片部分新生血管化。2.2电镜检查结果 上皮细胞形态自然，细胞连接紧密，细胞核染色质较均匀。胶原纤维大小均匀，排列整齐、紧密，连续性好，无崩解（见图1、2、3）（文章末页）。3 讨论细胞在冷冻状态下，代谢几乎停止，生命以相对静止状态得到保存，但是，在缓慢降温或升温时，水分子会有序排列形成冰晶，而冰晶化是造成细胞不可逆性死亡的主要原因[3]。甘油属多羟基化合物，羟基与水形成氢键，因此甘油具有很强的亲水性，可以轻易渗透至细胞内，限制和干扰细胞内外水分子按晶格排列形成冰晶，从而减轻冷冻过程冰晶对细胞造成的损害；另外，甘油渗入细胞内部，置换出细胞内的游离水和一些盐类，减轻了电解液浓度增加带来的不良影响；甘油还可保护细胞内的一些重要酶类免受冻害而逸出，从而保证解冻后细胞的活性；此外，甘油是很好的溶剂，易清洗,并具有抑菌作用[3]。甘油用作冷冻保护剂已有100余年的历史，是最为常用的冷冻保护剂，被广泛应用于红细胞、精子、细菌、人体组织器官等的长期活性保存[4-6]。在眼科领域，既往多利用甘油的脱水性能在4℃下对眼球进行保存，而非利用其冷冻保护剂的作用[1、2、7]。4℃下细胞代谢并未完全停止，加上甘油脱水的损害作用，这种方法保存的角膜组织没有活性，电镜检查显示角膜胶原组织的连续性、均匀性及紧密性均较差，临床应用效果欠佳，只是起到了纤维支架的作用，移植后植片多混浊[1]。借鉴甘油作为冷冻保护剂在其它领域的成功应用，我们详细分析了甘油低温冷冻保存角膜各个环节，充分考虑了可能影响保存效果的因素，对原来的甘油保存角膜方法进行了创新改造，从而形成一种新型的甘油冷冻保存角膜的方法。本方法与传统保存方法的不同之处在于：①-45℃以下低温冷冻保存，使细胞内外液体达到玻璃化，彻底抑制细胞代谢；②采取保存角膜片的方式而非保存眼球的方式进行保存。角膜片相对眼球面言体积小，含水少，因此能极大缩短冷冻或复温的时间，能使细胞内外的液体迅速达到玻璃态，从而避免有损细胞结构的冰晶形成[8]；③角膜内皮及上皮面涂抹透明质酸钠（SH）后，减缓了脱水的速度，有利于甘油置换出胞浆内的水分，避免了因细胞脱水迅速而导致的细胞骨架坍塌、细胞连接破坏等机械性损害，也可防止因胞浆浓缩导致的电解质浓度升高引起的化学淹滞性损害[3]；④透明质酸钠（SH）能保护细胞免受各种毒素及机械震动对细胞产生的损害作用[9、10]。本研究电镜检查及临床应用结果表明，-45℃以下长期甘油低温冷冻保存的角膜具有一定的活性，角膜结构保存完整，进行板层角膜移植有较高的透明率，基本符合临床板层角膜移植的要求，尤其对于紧急情况下眼外伤及角膜溃疡穿等的救治具有重要价值。参考文献1 蓝平，高明宏，阎玲，王世贤. 长期甘油保存角膜的光镜和电镜观察及临床应用[J].解放军医学杂志，2001，26：2062 邓爱军,康凤英,祝寿荣,刘晓方,李坤. 甘油干燥保存角膜内皮细胞活性的研究[J].山东医药，2000，40：5-63 中国农业大学，主编.家畜繁殖学（第三版）[M].北京：中国农业出版社，2000：160-1854 Hibino Y, Hata K, Horie K, Torii S, Ueda M. Structural changes and cell viability of cultured epithelium after freezing storage[J]. J Craniomaxillofac Surg,1996;24∶346-3515 韩颖,刘安,靳鹏,任素萍,权国波,马恩普,刘秀珍. 冰冻干燥红细胞超微结构的分析[J].中国实验血液学杂志, 2003;11(2)：191-1936 郭淑清,田锋. 菌种的甘油冷冻保存法[J]. 山西医科大学学报,2000;31（4）:3827 张廷钺,马吉献,于纯智.干燥保存角膜穿透移植实验与排斥反应[J].眼科新进展,1995,15：4-68 范军华，蒋华. 甘油冷冻长期保存兔角膜内皮细胞的活性[J]. 国际眼科杂志，2006；6：573-5779 凌沛学，主编.透明质酸[M].北京:中国轻工业出版社,2000：53-6210 Belda JI, Artoa A, Garcia-Manzanares MD, Ferrer C, Haroun HF, Hassanein A, Baeyens V, Munoz G, Alio JL. Hyaluronic acid combined with mannitol to improve protection against free-radical endothelial damage: experimental model[J]. J Cataract Refract Surg. 2005; 31(6): 1213-1218.图1 角膜片涂布SH后甘油冷冻保存13个月，上皮细胞形态自然，连接紧密，细胞核染色质较均匀 TEM x8k图2 角膜片涂布SH后甘油冷冻保存20个月，胶原纤维平行切片，见胶原排列整齐、紧密，连续性好，无绷解 TEM x15.0k图3 角膜片涂布SH后甘油冷冻保存16个月，胶原横断面，纤维排列整齐、紧密 TEM x15.0k

世上没有完美的人和事，说完美可能有点夸张，但追求完美是每个人做事的原则和努力方向。翼状胬肉是眼科最常见的眼病之一，也是很多眼科医生入门手术之一，胬肉手术上手容易，做好不容易，且做且珍惜！做得好，做好一个来一村，做不好，做坏一个一村不来。本人每年要做上六七百台的胬肉切除联合角膜缘干细胞移植手术，已手术5000例以上，一般每台的手术时间是15分钟，术后复发率在1%以下，从未发生角膜感染、巩膜溶解、睑球粘连等并发症。现就胬肉手术的一些心得与大家分享。要建立胬肉手术是美容手术的观点，除了要尽量减少复发，避免并发症，美观是胬肉手术的一个重要要求，如果术后切除区疤痕增生明显、长期充血、角膜遗留人为的白斑都是不可取的。翼状胬肉手术的三大要点：1、微创：尽量减少对角膜及巩膜的损伤，减少术后炎症刺激；术中避免对角膜进行切割、搔刮等损伤性操作，避免不必要的烧灼止血。2、彻底：对胬肉组织及肥厚增生筋膜组织必须切除彻底，减少术后复发的机会，术后更美观；3、平整：植片缝合必须平整，伤口对合好，线结少，这样炎症刺激少，病人更舒适，术后复发率更低。一般采取植片一个角与角膜缘先间断缝线固定一针，然后从另一个角连续缝合，这样线头少，对合平整，效果好。小胬肉也可采取本人首创的干细胞滑行移植法，操作简单，损伤小，线结少，线结位于睑裂区，无刺激感。这是一例翼状胬肉，手术过程中我们采取逆行撕除法，没有对角膜进行任何搔刮，术后角膜完全透明无斑翳。我们采取连续缝合法，植片平整，伤口对合好，术后反应轻，愈后结膜无明显疤痕。对于供区创面要缝合，尽量不影响以后的青光眼手术。这是术前，胬肉较大，充血明显，较肥厚。这是术后一周时，连续缝线在位，伤口对合整齐，干细胞片平整。这是术后3周复查，角膜透明，结膜无疤痕，基本看不出曾行胬肉手术，与正常眼无异。这是另一例术前术后1周时，连续缝合基本没有线头暴露。这是术后3周时复查，角膜透明无翳，结膜无疤痕。对于小的胬肉，我采取了独创的干细胞滑行移植术，刺激更小。这是术前术中采取胬肉切除联合干细胞滑行移植术，只需缝合4针左右，不需取片，操作简单，不影响手术，术后疼痛及异物感少，并发症少。术后外观自然，角膜结膜疤痕少。我们也曾收集一些其它医院术后的胬肉照片，部分患者由于各种原因，术后效果难以让人满意。仅提供一例外院术后的患者照片供参考：

许多重型角膜病患者由于得不到新鲜角膜移植而得不到有效治疗，本人通过改进角膜保存方法，提高角膜保存效果，使角膜资源得到充分利用，以备临床急需。同时通过创新手术方法，使得以保存角膜进行角膜移植获得与新鲜角膜相似的临床效果。