深圳儿童医院血液肿瘤科科普号

2019美国儿科学会1型神经纤维瘤病儿童的健康管理指南之一 Miller DT，Freedenberg D，Schorry E等。 儿童神经纤维瘤病1型的健康监督。 2019; 143（5）：e20190660 1型神经纤维瘤病是一种多系统疾病，主要累及皮肤和周围神经系统。其人口流行率约为1/3000。该病通常在儿童早期出现皮肤色素时被发现。尽管NF1临床变异性很大，但大多数患儿生长发育在正常范围。NF1的某些特征可能在出生时出现，但大多数表现随着年龄的增长而出现，因此需要定期监测，以满足持续的健康和发育需要，并将严重医疗并发症的风险降至最低。 在本报告中，我们回顾了确诊所需的临床标准、NF1的遗传模式、主要临床表现以及监测和干预的指导方针，以最大限度地提高患儿健康和生活质量。 前言 1型神经纤维瘤病是最常见的遗传性疾病，发病率约1/3000[1]。NF1的某些特征可能在出生时出现，但大多数表现随着年龄的增长而出现。自从发表“神经纤维瘤病儿童的健康监测”一文以来，健康监测和治疗的理论基础不断发展，需要进行更新。[2] 在本文中，我们只讨论与NF1的诊断和管理有关的问题，不应将其与神经纤维瘤病2型混淆，后者是一种独立的疾病，通常在儿童和青少年时期表现为皮肤神经鞘瘤和前庭神经鞘瘤，发病率为33000分之一，患病率低于50000分之一。 诊断和鉴别诊断 在关于NF1的美国国立卫生研究院（NIH）共识开发会议上，划定了7条标准，其中2条或更多条标准才能确定NF1的诊断。如下：1.六个以上咖啡斑，青春期前直径大于5毫米，青春期后直径大于15mm; 2.两个或两个以上任何类型的神经纤维瘤1个丛状神经纤维瘤;3. 腋窝或腹股沟区雀斑; 4.视路胶质瘤；5. 两个以上虹膜错构瘤（Lisch结节）；6. 特殊的骨骼异常，如蝶骨翼发育不良或长骨发育不良，有或无假性关节病；7.一级亲属（父母、兄弟姐妹或子女）根据上述标准诊断NF1。[3–6] 在非家族性儿科病例中，NF1的诊断可能很困难，因为某些临床表现是年龄依赖性的。NF1临床表现的变异性也使得难以预测患儿的未来表现。通常首先根据咖啡斑（CALM）怀疑儿童的NF1诊断。鉴别诊断包括伴有CALM或其他色素沉着表现的其他疾病。 通常，NF1中的CALM具有统一且规则的边界。在NF1中可能会出现形状不规则的“非典型CALM”，但如果不存在典型的CALM，还应考虑其他疾病。有些人肤色白皙，最多有6个浅色、边缘不规则的CALM，可能患有与该病无关的色素异型增生。[7] 还有其他一些较不常见的与CALM相关的疾病。看起来最类似于NF1的疾病是Legius综合征，它是由SPRED1中的致病变异引起的。 Legius综合征患者有多个咖啡斑和皱褶间的雀斑以及学习障碍和相对的大头畸形，与轻度NF1病例没有区别。[8] 患有Legius综合征的家庭不存在其他NF1的表现，如神经纤维瘤或其他肿瘤、眼科检查异常和骨骼表现。[9] 遗传学 NF1以常染色体显性方式遗传，但大约一半的患者为自发的NF1基因突变。尽管每个患者之间临床变化很大（即使在同一个家庭中也是如此），但每个具有NF1基因致病性变化的人都将显示NF1的某些特征。患有NF1的个体每次怀孕都有50％的机会生育NF1的孩子。 基因检测在诊断中的作用 NF1的分子诊断可基于对NF1基因中致病变异的DNA分析来进行，通常用血液样本检测。 在不同的患者中已经发现了数千种不同的变异类型，大多数会导致基因产物的功能丧失。 [10,11] NF1基因检测可以用于诊断或辅助遗传咨询。对于仅有咖啡斑的幼儿，NF1基因检测可以确诊。尽管基因检查正常不能完全排除患病的情况，但仍有95％的可靠性。 NF1基因的检测也可对表现出非典型特征（如孤立的丛状神经纤维瘤、视神经胶质瘤或胫骨发育不良）的儿童提供帮助。在这种情况下，血液检测通常是阴性的，因为遗传改变可能只发生在病变的组织中。在这种情况下，从病变中获得的组织检测NF1可能是阳性的，并提示体细胞镶嵌。表现为“节段性NF1”的儿童（通常为局限分布的CALM或皮褶雀斑，有时还分布有神经纤维瘤），在对病变组织进行活检或对来自咖啡斑的黑素细胞或神经纤维瘤的雪旺细胞进行分子检测后，也可以诊断为体细胞镶嵌症。[17] 尽管可能对成人性腺嵌合NF1突变基因的遗传及产前检查确定自发突变有帮助，但该方案通常不指导临床治疗，因此很少采用。基因自发突变患儿的健康父母生育另一个患儿的可能性很小，除非在随后的怀孕中发生种系镶嵌或新的自发突变。后者已经报道，但预计发生的可能性比种系镶嵌少。[18] 关于基因检测的总结和建议 1.NF1基因检测可以在没有临床表现的情况下提前确诊； 2.可以将NF1与Legius综合征区分开来; 3.对于表现出非典型临床特征的儿童可能会有所帮助； 4.但基因检测通常不能预测未来的并发症，以及可能无法检测到所有NF1病例；但基因检测阴性排除诊断NF1的敏感性不是100％，但有95％。 参考文献 略

一、概述儿童朗格汉斯细胞组织细胞增生症（LangerhansCellHistiocytosis,LCH）是一种罕见的组织细胞疾病。该病是朗格汉斯细胞（一种langerin阳性（CD207+）树突状抗原呈递细胞）的异常克隆性增殖和炎性浸润的肉芽肿，导致器官功能损伤。可能出现在几乎任何器官系统中，但最常见的病变位于骨骼80%、皮肤33%、肺和垂体25%。它是一种由于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的几种基因突变引起的罕见的炎症性髓系肿瘤。约50%的病例存在BRAFV600E突变，另有部分病例涉及MAP2K1等基因突变，激活MAPK信号通路，驱动细胞异常增殖。  二、临床表现本病儿童发病率4-5/百万，于胎儿至老年各个年龄阶段均可发生，但好发于儿童，1-5岁为高发人群，男性比例稍多于女性，1.5-3.7:1。LCH的临床表现多样，常见于1-3岁儿童，可长期仅表现为轻微皮疹，单部位骨骼损害，无明确临床进展。也可表现为多个重要脏器受累，病情进展迅速，甚至导致死亡。最常累及脏器为骨骼（80%），皮肤（33%）和垂体（25%），其他累及器官主要有肝，脾，造血系统，肺（15%），淋巴结（5-10%）以及中枢神经系统。   骨骼病变：溶骨性破坏（如颅骨“地图样缺损”、扁平椎）、骨痛或肿胀。    皮肤病变：躯干或头皮的红色丘疹、湿疹样皮疹或出血性皮损。    中枢神经系统：尿崩症（垂体或下丘脑受累）、共济失调或癫痫。    其他：肝脾肿大、淋巴结病变、反复肺部感染（气胸、呼吸困难）。  危险器官：造血系统、肝、脾受累提示预后不良，死亡率显著升高。三、分类LCH分类：累及范围不同可分为：单系统LCH（Single-systemLCH，SS-LCH），多系统LCH（Multi-systemLCH，MS-LCH），根据受累器官不同可分为：高危：危险器官(肝、脾、骨髓)受累，即为高危。低危：无任何危险器官受累，则为低危。四、诊断    -病理活检：金标准，需免疫组化显示CD1a和CD207阳性，或电镜发现Birbeck颗粒。    -影像学检查：骨骼X线/CT显示溶骨性破坏，胸部高分辨CT可见网状结节或囊腔。    -实验室检查：血常规（贫血、血小板减少）、炎症标志物（血沉、CRP升高）。  五、治疗与预后    -单系统疾病（如孤立性骨或皮肤病变）：受累器官为骨、皮肤或淋巴结的患者具有良好的预后，仅需要小剂量的化疗甚至不需要治疗。局部治疗（刮除术、激素注射）或观察。    -多系统疾病：多系统受累的LCH需要给予全身化疗。联合化疗（如长春碱+泼尼松），靶向治疗（BRAF抑制剂维莫非尼）用于突变阳性患者。    -支持治疗：尿崩症用去氨加压素，内分泌异常需激素替代。  六、预后因素    -低危（无危险器官受累）：2岁以上儿童5年生存率>80%。    -高危（肝、脾或造血系统受累）：5年生存率约50%-80%。    -复发风险：46%的患者5年内复发，多发生于骨骼。

皮肤的色素性病变在儿童中很常见，比如雀斑、牛奶咖啡斑、贝克尔痣和真皮黑色素细胞瘤（蒙古斑、太田痣）。但一些色素性病变和肿瘤有很强的相关性，比如雀斑样痣和牛奶咖啡斑。见附表。雀斑样痣是由表皮黑素细胞活性增加引起的良性色素斑。有两种主要类型：单纯雀斑样痣和日光相关的雀斑样痣。单纯雀斑样痣在儿童期常表现为边缘清晰、圆形到椭圆形、均匀的棕色或棕黑色斑点，直径通常小于5毫米。数量较少，通常位于身体的非阳光暴露的部位。图1日光相关的雀斑样痣只出现在阳光照射的区域，发生率随着年龄的增长而增加，最常见于成年人。但可能发生在皮肤颜色较浅的儿童身上。通常为多个棕褐色至深褐色斑点，边界不规则。病变直径从几毫米到>1厘米不等。图2此外，粘膜黑色素沉着斑也是一种单纯性雀斑样痣，位于粘膜表面，特别是下唇。图3多发性口周和口腔粘膜黑色素沉着斑是一些与肿瘤有关的先天性疾病的特征，如Peutz-Jeghers和Laugier-Hunziker综合征。牛奶咖啡斑是一种不高出皮肤的色素性病变，颜色从棕褐色到深棕色不等，大小从几毫米到>15厘米，随着儿童的生长而成比例增大。图4可能出现在出生时或儿童早期，通常在阳光照射后变得明显。牛奶咖啡斑的区域黑色素生成增加，多数病因不清楚。少数与McCuneAlbright综合征（由GNAS基因的体细胞突变引起）或1型神经纤维瘤病（由NF1基因的突变引起）等疾病相关。25%至35%的儿童有一个牛奶咖啡斑，但只有<1%的儿童有3个以上的牛奶咖啡斑。

I型神经纤维瘤病（NF1）是由NF1基因突变引起累及多系统的遗传性疾病，多在儿童期发病，伴随多种症状，包括色素沉着（牛奶咖啡斑）、在皮肤或体内形成神经纤维瘤等。30%~50%的NF1患者会伴发丛状神经纤维瘤（PN），PN沿神经长轴呈弥漫性生长，可累及多条神经干、分支及神经丛，可侵及周围组织，引起毁容、疼痛、运动及呼吸功能障碍、视力受损以及膀胱或肠道功能障碍等。此前手术是神经纤维瘤的最主要治疗方法，但手术治疗通常仅限于对较大病变的特定区域进行减瘤，对于瘤体巨大、或瘤体位于头颈部等部位的尤其是伴有PN的患者，手术治疗效果有限，常常难以完全切除，且复发率高，并且PN有转化为恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的风险。司美替尼是一种丝裂酶原激活蛋白激酶（MEK）抑制剂。MEK是细胞外信号相关激酶（ERK）通路的上游调节因子，抑制MEK的活性能够通过抑制RAS调节RAF/MEK/ERK通路活性，抑制肿瘤生长。2021年发表在《新英格兰杂志》上司美替尼临床SPRINT研究显示对于伴有PN的NF1儿童患者的积极治疗结果。结果显示，经每日两次口服司美替尼治疗后的客观缓解率（ORR）达到68%[注：ORR是指完全缓解（丛状神经纤维瘤消失）或出现部分缓解（瘤体体积缩小至少20%）的患者百分比]。相较于自然史患者3年仅15%的无疾病进展率，研究中经司美替尼治疗的患者3年无疾病进展率高达84%，74%的患者疼痛评分降低2分及以上，运动功能障碍得到有效改善，生活质量得到显著提升。安全性数据显示，12个治疗周期内患者用药依从性超95%。上文内容来源：https://mp.weixin.qq.com/s/DwA8CvrMbsf7on8VSAIWaw

2021年国际神经纤维瘤病诊断标准共识组修正的神经纤维瘤病1型（NF1）诊断标准：1.    6个或以上咖啡牛奶斑，在青春期前直径＞5ｍｍ，或在青春期后直径＞15ｍｍ；2.    2个或以上任何类型的神经纤维瘤或1个丛状神经纤维瘤；3.    腋窝或腹股沟区雀斑；4.    视路胶质瘤；5.    裂隙灯检查到2个或以上Lisch结节，或光学相干层析成像（OCT）/近红外影像检查到2个或以上的脉络膜异常；6.    特征性骨病变，如蝶骨发育不良、胫骨前外侧弯曲，或长骨假关节生成。7.    在正常组织（如白细胞）中具有等位基因变体分数达50%的致病杂合子NF1变异体。父母正常的患者，满足上述7条中的2条可诊断为NF1；父母患病的患者，满足1条即可诊断为NF1。

小鼠分化培养的神经元中Nf1无义突变基因的功能恢复本文内容来自ChanWu,SukanyaIyer,ScotA.WolfeandAllanJacobson，https://doi.org/10.1038/s10038-022-01072-7.仅供专业人士参考。 1型神经纤维瘤病（NF1）是最常见的常染色体显性遗传疾病之一，由NF1基因突变引起。NF1患者有各种各样的表现，其中一些患者患中枢神经系统肿瘤的风险很高。NF1的无义突变导致截短的NF1蛋白（神经纤维蛋白），与中枢神经系统肿瘤相关。用小分子药物抑制无义突变、恢复含无义突变的基因表达是一种潜在的治疗方法。阿他鲁仑（Ataluren）已被证明在几种无义突变的疾病模型中及以及在无义突变的Duchenne型肌营养不良患者中恢复功能蛋白的全长。为了测试Ataluren对与中枢神经系统肿瘤相关的NF1无义突变的潜在价值，我们构建了纯合的Nf1R683X/R683X-3X-FLAG小鼠胚胎干（mES）细胞系，该细胞系重现了NF1患者的无义突变（c.2041c>T；p.Arg681X）。我们在体外将Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞分化为皮质神经元，用Ataluren处理细胞，并证明Ataluren可以促进神经细胞中Nf1mRNA密码子683处无义突变的读出。所得到的全长蛋白能够降低细胞内过度活化磷酸化ERK（pERK）的水平，而pERK是一种通常被NF1蛋白抑制的RAS效应物。 前言1型神经纤维瘤病（NF1）是人类最常见的遗传病之一[1]，由NF1基因突变引起。NF1的特点是多种表现，包括牛奶咖啡斑、皮褶处雀斑、Lisch结节、视神经胶质瘤、骨损伤、认知缺陷以及中枢和外周神经系统的肿瘤[2，3]。NF1是人类最大的基因之一，位于染色体17q11.2上，横跨约300kb的基因组DNA，编码2818个氨基酸的蛋白质，称为神经纤维蛋白[4，5]。NF1在哺乳动物中高度保守，因此，小鼠神经纤维蛋白与人类神经纤维蛋白的同源性为98.5%[6]。NF1主要在神经系统中表达[7]，并作为肿瘤抑制剂发挥作用。它负调节Ras/ERK信号通路，并通过其GTPase激活蛋白相关结构域正调节cAMP水平[8-14]。迄今为止，已发现近3000种不同的NF1突变，其中相当一部分是无义突变[15-17]。无义突变在灭活NF1功能方面特别有效，因为无义突变导致提前出现的终止密码子（PTCs），通常会导致截短的非功能性神经纤维蛋白的合成，并通过无义介导的mRNA衰变途径加速mRNA降解[18-23]。尽管还没有批准用于针对NF1无义突变的药物，但抑制无义突变可能是NF1潜在的方法[3，24，25]。阿他鲁仑是一种小分子药物，被证明可以促进无义抑制，即有效恢复含PTC的mRNA的功能表达[25，26]。重要的是，Ataluren具有良好的安全性记录，可以穿透中枢神经系统，已被证明在改善Duchenne型肌营养不良症（DMD）患者的肌肉功能方面有效[27-29]，并被批准为第一个入选欧盟治疗DMD的药物[30]。因此，ataluren可能是治疗无义突变NF1患者的一种有前途的药物。外显子18的无义突变（c.2041c>T；p.Arg681X）是NF1患者中发现的最常见的无义突变之一[31，32]。其小鼠对应突变位于外显子18（c.2047c>T；p.Arg683X）。通过将Nf1基因胚系突变R683X和神经胶质祖细胞中胶质原纤维酸蛋白Cre的体细胞敲除结合，已建立了相应的小鼠视路胶质瘤模型[33]。由于纯合的Nf1R683X/R683X是小鼠胚胎的致死性突变[31]，因此仍然缺乏纯合的Nf1无义突变的模型。为了更好地理解Nf1的功能，并评估无义突变神经纤维瘤病的潜在治疗方法，我们通过CRISPR/Cas敲入，产生了Nf1R683X/R683X的纯合小鼠胚胎干（mES）细胞模型，并在两个Nf1无义等位基因上添加了C端3X-FLAG标签，以便于分析Ataluren介导的密码子683处的PTC读取。我们发现Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞可以在体外分化为皮层神经元，这可能是研究中枢神经系统（CNS）中Nf1功能的一个极好的模型。使用该模型，我们用Ataluren处理Nf1R683X/R683X-3X-FLAG来源的神经元，并证明：（a）ataluren可以促进Nf1mRNA中PTC的读出，以及（b）所产生的全长神经纤维蛋白能够抑制过度活化的pERK的表达。 材料和方法mES细胞培养、神经分化和通读治疗mES细胞在明胶涂层的培养皿（0.2%明胶）上生长，并保持在ES培养基（500ml敲除DMEM培养基，ThermoFisherScientific，10829018）中，补充有10%胎牛血清（SigmaAldrich，F2442），1×非必需氨基酸（Invitrogen，11140050），2mML-谷氨酰胺（Invitrigen，25030081），1×青霉素/链霉素（ThermoFisherScientific，15140122），5×107单位LIF（Sigma-Aldrich，ESG1107）、4.5μl2-巯基乙醇）。每天更换媒介。每隔一天对细胞进行重新接种。根据Gaspard等人[34]，mES细胞分化为皮质神经元。简言之，在神经诱导前一天，将3.5×104至4×104个细胞接种在ES培养基中的60mm明胶涂层培养皿上。分化第0天，培养基替换为DDM（DMEM/F12，GlutaMAX（ThermoFisherScientific，10565018），补充1xN2补充剂（Thermo费希尔科学，17502048），0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠（ThermoFisherScientific，11360070），500mg/mlBSA（ThermoFisher科学，15260037），0.1mM2-巯基乙醇，50U/ml青霉素和链霉素）。分化第2–9天，培养基每天替换为补充有1μM环巴胺的DDM（Sigma-Aldrich，239803）。在分化第10-11天，仅用DDM替换培养基。在分化第12天，1.5×107个细胞重新接种于多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白涂覆的100mm培养皿上，并保持在N2/B27培养基（神经基础/B27培养液（Neurobased（ThermoFisherScientific，21103049）的1:1混合物）中，补充1xB27（ThermoFisherScientific，12587010）、2mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素和链霉素）和DDM）。此时，将细胞与通读药物（ataluren或G418）或对照（DMSO）孵育。 Nf1-3X-FLAG和Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞的构建表1列出了本研究中使用的寡核苷酸、引导RNA间隔序列和供体DNA序列。通过IDTdna合成了LbCas12acr1引物、ssODNFLAG供体和ssODN-R683X供体。先前文献描述了3xNLS-SpCas9和2xNLS-LbCas12a蛋白的纯化[35]。将LbCas12a或SpCas9蛋白分别与cr1或sg1预复合，将供体ssODN-FLAG或ssODN-R683X添加到复合物中，并使用Neon转染系统10µL试剂盒（ThermoFisherScientific）电穿孔进入mES细胞或Nf1-3X-FLAG细胞。为了产生Nf1-3X-FLAGmES细胞，在室温下，将20pmol的LbCas12a蛋白与60pmol的cr1在缓冲液R中络合20min，然后将20pmmol的供体ssODNFLAG添加至12μl的最终体积。每个反应1×105mES细胞重新悬浮在10μlRNP缓冲液R混合物中，并使用以下参数进行电穿孔：脉冲电压，1600V；脉冲宽度，10ms；脉冲数为3。然后在InDel分析和单细胞分离之前，将细胞置于24孔板中，用500μl不含抗生素的ES培养基培养4天。为了产生Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞，将20pmol的SpCas9蛋白与25pmol的sg1在缓冲液R中复合20min，然后将40pmol的供体ssODN-R683X加入，最终的体积为12µl。每个反应1×105个Nf1-3X-FLAGmES细胞再悬浮在10µlRNP缓冲液R混合物中，并使用以下参数进行电穿孔：脉冲电压，1600V；脉冲宽度，10ms；脉冲数为3。在分析和单细胞分离之前，将细胞用500µl不含抗生素的ES培养基接种在24孔板中4天。使用表1中列出的寡核苷酸通过测序验证单细胞集落。对于脱靶分析，我们通过PCR扩增和桑格测序测试了前四个潜在脱靶位点或LbCas12a:cr1，以及前三个潜在的SpCas9:sg1脱靶位点，这是CasOFFinder[36]预测的。没有发现任何潜在的非靶位点有突变。免疫沉淀和蛋白质印迹通过刮入补充有1x磷酸酶/蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液来收获mES衍生的神经细胞（细胞信号，5872）。测量蛋白质浓度，使用PierceBCA蛋白质测定试剂盒（ThermoFisherScientific，23225）。每个样品50μg裂解物用于SDS-PAGE输入。对于抗FLAG免疫沉淀，每个反应600μg总蛋白与抗FLAGM2磁珠（SigmaAldrich，M8823）在4°C下孵育过夜。清洗三次后，使用TBS（20mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl），通过在2xLaemmli缓冲液中煮沸5分钟来洗脱结合的蛋白质，在SDS-PAGE上解析，并转移到PVDF膜（Millipore，IPVH0010）上。PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭，然后过夜。在4°C条件下，使用以下一级抗体：抗神经纤维蛋白1（细胞信号，14623，1:200）、抗TUJ1（Biolegend，801201，1:1000）、抗pERK（细胞信号传导，9101，1:1000）、抗ERK（细胞信号转导，9102，1:1000 抗GAPDH（Abcamb9485，1:1000）。随后，用PBST（137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、1.8mMKH2PO4、0.1%吐温）洗涤印迹三次，然后用二级抗体探测，包括抗小鼠（ThermoFisherScientific，A24506，1:5000）和抗-兔子（SigmaAldrich，ENA934，1:5000）在室温下孵育1小时。使用ECL试剂（ThermoFisherScientific，34095）和CLXposure膜（ThermoFisherScientific，34090）。 结果Nf1R683X/R683X-3X-FLAG小鼠胚胎干细胞系的产生为了产生具有纯合R683X无义突变的永生Nf1细胞系，我们从源自129/OLA株的mES细胞系开始，使用CRISPR/LbCas12a基因组编辑，在Nf1ORF的C末端敲入框内3X-FLAG标签。随后，通过CRISPR/Cas9敲入，在外显子18中引入无义突变（c.2047c>T；p.R683X）（图1A）。对于FLAG标签敲入，我们设计并测试了一种LbCas12a的crRNA，其会在标准Nf1终止密码子处产生交错的双股断裂（DSB）（图1B，上图，红色三角形）。合成的crRNA与纯化的LbCas12a蛋白复合，与用作供体模板的3X-FLAG单链寡脱氧核苷酸（ssODN）一起，电穿孔到mES细胞中用于3X-FLAG插入。四天后，通过DNA测序分析含Nf1翻译终止位点的基因组区域的插入、缺失（InDels）和同源性定向修复（HDR）。我们观察到16%HDR的高基因编辑效率（约88%InDels率）（表2）。分离出48个单克隆并进行基因分型，鉴定出两个纯合的Nf1-3X-FLAG敲入细胞系。显示3X-FLAG序列插入的代表性测序色谱图如图1C所示。    接下来，我们使用CRISPR/Cas9基因组编辑，在Nf1-3X-FLAG的细胞系中引2047C>T突变。为SpCas9设计了单引导RNA（sgRNA）用以在远离突变位点的四个碱基对处生成DSB（图1B，bottompanel，红色三角形）。纯化的SpCas9与合成的sgRNA和SpCas9:sgRNA复合物以及ssODN模板（具有2047C>T突变）电穿孔到Nf1-3XFLAG细胞中以产生2047C>T突变。四天后，分析外显子18基因组区域的编辑效率，观察到InDels和HDR的比率分别为约70%和29%。我们分离了250个单克隆并行基因分型，鉴定了四个纯合的Nf1R683X/R683X-3X-FLAG细胞系。正确编辑克隆的代表性色谱图如图1C所示。因此，我们成功地构建了所需的Nf1R683X/R683X-3X-FLAG细胞系。 Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞分化为神经元细胞由于患有NF1的个体可能发展成中枢神经系统肿瘤[37]，我们将Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞分化为皮层神经元，以模拟CNS肿瘤微环境。我们遵循了Gaspard等人的方案[34]，该方案在体外成功地将mES细胞分化为皮层神经元，仅改变了神经诱导的mES细胞密度。诱导方案的简化时间表如图2A所示。我们通过分析分化细胞的形态监测分化过程的进展。分化第10天Nf1-3X-FLAGmES细胞衍生的神经元祖细胞克隆的正常形态如图2B所示。在分化第12天将祖细胞和神经元复制到多聚赖氨酸/层粘连蛋白涂层的培养皿上后，在分化第13天观察到mES细胞衍生的神经元的神经突起（图2C）。Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞显示出与其他野生型细胞类似的诱导过程，包括正常的神经形态（图2D）。根据分化方案，在分化时接种的mES细胞密度应影响分化效率[34]，因此我们确定了mES细胞所需的适当细胞密度。利用westernblotting，通过分化第12天TUJ1蛋白（神经元的标记）的表达来鉴定分化的细胞（图2E）。当分析相同量的总蛋白（200ug），并通过内部控制蛋白GAPDH的水平比较样品时，我们观察到当mES细胞的初始铺板密度较低时，形成了较高百分比的神经元（参见图2E中的抗TUJ1信号；与泳道2和4相比，泳道1和3装载了来自较低量的起始mES细胞的细胞裂解物）。野生型Nf1-3X-FLAGmES细胞衍生的神经元表现出NF1表达，而Nf1R683X/R683X-3X-FLAG衍生的神经元没有（图2E，抗NF1抗体）。我们对于Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞诱导神经元过程的观察，并且在对应的分化的神经元中缺乏NF1蛋白，表明我们已经在皮层神经元中建立了用于分析NF1无义突变的模型细胞系。Nf1R683X/R683X-3X-FLAG皮层神经元对通读促进药物的反应为了测试Nf1R683X/R683X-3X-FLAG神经元是否对通读促进药物有反应，我们用ataluren或G418处理，并分别评估全长NF1的水平，由于G418的阅读促进活性高于ataluren，因此用于对照，但由于其毒性，G418不能用于治疗[24]。由于全长NF1的表达水平相当低，我们在所有治疗组和对照组中用FLAG亲和珠的免疫沉淀（IP）富集NF1蛋白，然后通过抗NF1抗体的蛋白质印迹评估蛋白水平。这些实验显示，在药物治疗两天或三天后，全长NF1的水平适度增加，即，在ataluren和G418样品中，通读的NF1水平略高于DMSO对照， 参见IP频带（图3A，C）。之前已经表明，NF1的损失导致磷酸化ERK（pERK）的过度活化[31，33，38，39]。因此，我们将药物处理的神经元中的pERK水平进行比较，以评估NF1全长通读蛋白的功能。实验表明处理后2天Nf1R683X/R683X-3XFLAG神经元中的pERK水平没有降低（数据未显示），但处理后3天pERK明显降低（图3C，D、G418和ataluren）。我们推测，处理2天的Nf1R683X/R683X-3X-FLAG神经元中全长NF1蛋白的水平不足以抑制异常Ras信号和ERK磷酸化。测试了三种不同剂量的ataluren的通读促进效率，但每种剂量在全长NF1的产生方面差异不大。Nf1-（图3A，B）。NF1蛋白表达不明显。它太低，无法在包含50ug蛋白质的输入样品中检测到（图3B），但当溶解更大量的裂解物时可以检测到（见图2E）。我们的数据表明，Nf1R683X/R683X3X-FLAG皮层神经元对直通治疗有反应，并证明了ataluren在促进Nf1R6830X/R683X3X-FLAG细胞合成功能性全长NF1蛋白方面的有效性。 讨论NF1患者发展为良性和恶性中枢神经系统的肿瘤的风险很高，大多为胶质瘤，肿瘤位置、发病年龄和严重程度有巨大的异质性[37].通过Cre-Lox技术，将体细胞Nf1缺失与种系Nf1敲除相结合，已生成Nf1视神经胶质瘤小鼠模型[33，37，40]。这些模型在揭示Nf1相关胶质瘤的病理学方面提供了信息，例如细胞的起源、肿瘤的进展、肿瘤微环境的作用以及遗传因素的作用（性别、生殖系突变和其他基因突变的存在）。然而，用于研究CNS中的Nf1功能的纯合Nf1突变模型仍然缺乏。在这里，我们报道了由CRISPR/Cas衍生的Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞产生的皮层神经元的Nf1无义突变模型。我们采用的方法比培育Nf1胶质瘤小鼠耗时更少，并且在生成分化神经元方面可靠[34]。体外分化过程重现了皮质发育的复杂性，因此为在神经祖细胞和神经生成或胶质发生中研究Nf1的功能提供了一个潜在的强大工具。这些神经元还可能有助于发现新的抑制Nf1无义的药物，并评估临床前研究。无义突变在NF1患者中非常常见[41-44]，约占所有报告病例的15-20%，且更可能与NF1相关的脑肿瘤有关[15，17，22]。因此，对无义抑制疗法的研究可以克服翻译过早终止，很多NF1患者可能获益。在本报告中，我们证明了促人类细胞和患者无义密码子读写的药物ataluren[25，26]，可以抑制NF1无义突变。我们用ataluren处理Nf1R683X/R683X-3X-FLAGmES细胞的神经元，发现可以促进由R683X突变产生的PTC的读取，并产生能够降低pERK水平的全长NF1（图3C，D）。这表明，ataluren可能是治疗NF1无义突变的一种潜在药物。尽管如此，神经纤维蛋白水平需要恢复到何种程度才能缓解NF1的多种表现以及ataluren对其他NF1无义突变的适用性仍有待确定。 参考文献及图表略

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MillerDT，FreedenbergD，SchorryE等。儿童神经纤维瘤病1型的健康监督。2019;143（5）：e20190660五．与NF1相关的恶性肿瘤  儿童中与NF1相关的最常见的肿瘤的是恶性外周神经鞘瘤（MPNST）、神经胶质瘤、嗜铬细胞瘤和白血病。恶性肿瘤是NF1最令人担忧的并发症。恶性肿瘤（主要是MPNSTs）和心血管并发症是NF1预期寿命降低的主要原因，但这主要在成人中出现。NF1患者的预期寿命比普通人群减少8至15年。[36,37]      MPNST通常是由丛状或结节性神经纤维瘤恶性转化而来。对于NF1的个体，一生中患MPNST的风险为8％至13％。MPNST通常会在青春期或青春期后发生。[38]治疗包括手术切除、放疗和化疗。但5年生存率仍不到20％。有以下症状的患者应警惕发生恶性转化的可能：丛状神经纤维瘤伴疼痛（尤其是持续性疼痛或使患者从睡眠中醒来的疼痛）；丛状神经纤维瘤快速生长或质地变化（例如从柔软易弯曲到致密和坚硬）。有症状的患者应该对患处进行MRI检查，并考虑PET-CT扫描。目前正在探索针对MPNSTs的靶向药物疗法，但仅用作手术的辅助疗法，效果不如广泛的手术切除。其他小儿恶性肿瘤在NF1中的发生率较低，包括低级别至高级别星形细胞瘤、横纹肌肉瘤、嗜铬细胞瘤和幼年粒单核细胞白血病。[41]高级别星形细胞瘤往往发生在老年人中，后颅窝的低级别星形细胞瘤或神经胶质瘤可能是有症状的。嗜铬细胞瘤可导致儿茶酚胺浓度升高和随之而来的高血压，但在NF1患儿中很少见。如果心率或血压剧增，建议筛检嗜铬细胞瘤。与一般人群相比，患有NF1的年轻人乳腺癌的发病率更高。[43,44]NF1相关恶性肿瘤的摘要和建议1.    MPNST最常见于丛状神经纤维瘤内。2.     PET-CT扫描可能对检测丛状神经纤维瘤的恶变有帮助。3.    高血压可能表明存在嗜铬细胞瘤，但大多数患者偶然发现高血压。4.    NF1的年轻成人患乳腺癌的风险增加。5.    NF1可能会发生其他类型的恶性肿瘤。六．神经系统表现  患有NF1的人更容易出现头痛，尤其是常见的偏头痛。[45]根据症状的严重程度，可能需要进行脑部MRI检查，但如果头痛易于控制且神经系统检查正常，则不需要MRI检查。存在颅内压升高的症状、中枢神经系统功能缺损或癫痫发作等提示颅内肿块症状时须作头颅MRI检查。与普通人群相比，患有NF1的个体更容易发生癫痫。癫痫发作风险可能部分归因于NF1个体的结构或血管变化。[46]癫痫发作可以在任何年龄发生，通常是局灶性的，并且需要关注局灶性中枢神经系统病变。建议在出现新的癫痫发作时进行脑部MRI神经影像学检查。七．影像诊断注意事项    影像诊断通常用于NF1患者的监测，例如肿瘤监测。根据临床表现来确定是否、何时以及在何处检查是标准做法。MRI是对丛状神经纤维瘤和脑病变（例如OPG和低级别神经胶质瘤）影像诊断的最常见方式。除MRI外，PET-CT可用于评估神经纤维瘤可能发生的恶性转化。在没有进展迹象的情况下评估丛状神经纤维瘤的影像学价值值得商榷，因为治疗决策通常基于临床而不是影像学。因此，检查最好由经验丰富的医生来决定。八．神经发育患有NF1的婴幼儿可能有轻度运动发育延迟，例如肌肉张力减退，通常会在儿童时期逐渐改善。NF1人群的言语和语言问题（尤其是口语运动障碍，包括通过适当治疗可以改善的言语功能障碍，）、腭咽闭合不全、口齿不清和言语不流畅等的发生率增加。[47,48]NF1病人的听力通常不佳。大约50％的NF1患者存在某种学习问题。[49,50]少数患者的智力残疾发生率略高于普通人群。至少在50％的NF1患者中存在典型的学习困难包括执行功能问题和非语言学习障碍，例如处理速度降低、注意缺陷/多动障碍，治疗方法类似于普通人群。[49]NF1患者是否会发生学习障碍是不可预测的，因此，应仔细观察每位NF1患儿的学习情况。一些研究表明NF1增加了对自闭症谱系障碍的易感性。[51–53]许多患有NF1的人，特别是青少年，表现出社交语用上的困难，即使没有正式诊断为自闭症谱系障碍，也可能对社交适应产生不利影响。与同龄人相比，患有NF1的人通常具有延迟社交成熟的个性特征。由于这个原因，也许还有其他原因，他们经常会感到焦虑。经常需要帮助并学习应对社交焦虑的技巧。关于儿童发展问题的总结和建议1.     学习障碍在NF1患者中很常见，在NF1微缺失或基因完全缺失的患者中通常更为严重。2.    言语表达困难是常见的，许多NF1患者需要言语治疗。3.    执行功能和注意力通常会受到影响，因此需要进行神经心理学测试来确定每个人面临的特定挑战。4.     社交困难很普遍，但自闭症的发病率尚不清楚；因社交焦虑或应对困难可转介心理治疗。参考文献略 

MillerDT，FreedenbergD，SchorryE等。儿童神经纤维瘤病1型的健康监督。2019;143（5）：e20190660 四．中枢神经系统胶质瘤（一）.视路胶质瘤视路胶质瘤（OPG）是在NF1儿童中最常见的中枢神经系统（CNS）肿瘤，NF1儿童的发生时率大约为15％至20％。[26,27]对于6岁以下的儿童，OPG通常在眼科检查时发现。大多数OPG为毛细胞星形细胞瘤（WHO1级）。大多数OPG不影响视力，但一小部分会导致视力下降和其他症状如性早熟。无法可靠地预测哪些OPG会导致视觉下降。位于视交叉和后视路的病OPG可能需要治疗。位于下丘脑附近或累及下丘脑的OPG容易导致性早熟。[27]数据还显示，女性OPG患者更有可能进展并需要治疗，但男性和女性患者均应接受相同的监测。[28–30]从确诊或疑似NF1起，儿童至少每年需眼科检查1次，如存在问题，应更频繁地进行复查。OPG最常在6岁之前进展，这时可能难以获得可靠的眼科评估，并且儿童不太可能描述视觉症状。由于这些原因，有人建议应更频繁地进行筛查，例如在6岁之前每6个月筛查一次，但这尚未成为标准的做法。[31]在NF1的患者中使用神经影像学来筛查和监测也有争议。视路工作组（theOpticPathwayTaskForce）不建议使用MRI筛查，[26]但也有人认为通过MRI早期发现OPG可改善幼儿结局。[32,33]因为OPG有可能使下丘脑受累，建议对所有患者定期进行青春期早期发育监测和身高增长加速的监测。共识是，眼科检查应至少每年一次，对无症状的儿童是否进行更频繁的监测或使用诊断成像最好由主管医生来决定。NF1患者的OPG预后要好于没有NF1的OPG。当出现视力下降、视野缩小、色觉改变或瞳孔向心性缺损时应考虑治疗。治疗后约三分之二的人视力稳定或改善。尽管有新的靶向NF1的特异性治疗可能用于进展复发的情况，但最初治疗常使用传统化疗（长春新碱和卡铂）。除极少数情况外，放射治疗和手术通常存在禁忌。（二）.关于OPG的摘要和建议1.OPG发病率最高的是6岁以下的儿童，但年幼的儿童不太可能描述症状； 不到一半的OPG患者出现视力丧失或其他症状；身高增长率的变化可能表明存在影响下丘脑-垂体轴的OPG，但不是化疗的适应症，如果需要可以由内分泌科进行治疗。2.化疗通常可以有效地阻止进一步的视力丧失或改善视力，因此早期治疗至关重要。   3.NF1儿童的眼科检查应至少每年一次。4.神经影像学对NF1儿童可选择性检查，但如果出现下表中的体征和症状，则必须进行。表NF1儿童的神经影像学研究适应症  考虑进行神经影像学检查的适应症     局灶性感觉或运动异常    癫痫新发作    头痛的发生频率或严重程度不断增加    颅内压升高的迹象（头痛、视力障碍、嗜睡）    短暂性脑缺血发作或中风样症状    视力或视野下降    性早熟或生长加速    头颈丛状神经纤维瘤增大或伴有新的疼痛感    脑病或认知能力减退    肢体不对称（如腿长差异） （三）.NF1的头颅MRI表现、低级别胶质瘤和脑干增粗NF1患者最常见的表现之一是在头颅MRIT2加权上出现高信号，主要出现在基底节、脑干和小脑。曾被称为“身份不明的明亮物体”、“信号强度焦点区”、“NF点”或“海绵状改变”，因为这些病变的本质和意义仍未确定，所以目前最合适的名称是“T2高信号”。这些病变在2-10岁之间明显，在10岁后消退。如果核磁共振T2加权高信号显示对比度增强或肿块效应，应怀疑为低级别胶质瘤。NF1患者的低级别神经胶质瘤可以在大脑的任何地方发生。[34]脑干是T2加权高信号和低级别神经胶质瘤的共同区域，后者通常伴或不伴强化的脑干增粗。很少对脑干神经胶质瘤进行活检，以避免医源性症状。脑干神经胶质瘤通常是良性的，只有三分之一或更少的病例在临床上进展。[35]发现脑干增粗的NF1患儿须监测临床症状，包括头痛、脑积水或颅神经功能障碍等。与NF1相关的脑干神经胶质瘤比OPG更为惰性，通常不需要临床干预或治疗，保守治疗通常是最佳的。 参考文献略