铁岭市中心医院科普号

患者：侵润性导管癌在 辽宁肿瘤医院做的手术 想问问您 回铁岭做化疗可以吗铁岭市中心医院乳腺外科常志坤： 当然可以，你带着出院小结（主要是手术后病理报告：肿瘤大小、类型、淋巴结转移情况、免疫组化等）直接到乳腺科病房找我即可。化疗方案我们就可以制定，如果你已经在省肿瘤定过也可以参考的。有时我可能会有手术，来之前先给我电话联系吧。135******** 我们的优势是化疗人性化、个体化，化疗副反应小，很少有病人出现恶性、呕吐等症状，患者耐受良好，家属照顾方便，医保、农合患者出院时直接报销，不需垫付，报销比例高（医保80-90%，农合60-70%）。您的病情已经了解，建议：点击此处参考我的文章 《诊疗范围、特色》

目前乳腺疾病检查的“金三联”是医生体格检查、乳腺彩超检查和钼靶检查，必要时可以做核磁检查、穿刺或手术活检。 超声检查是通过超声回声不同来判断是否有疾病，超声检查可以观测到肿块的特征、形态、鉴别囊实性、有无钙化和血流情况等。它的使用对人体无害，可以定期反复使用。钼靶检查是通过X射线进行的一项针对乳腺的专业检查，可以观测到患病乳腺与对侧比较的不对称性、肿块的形态、钙化的大小类型和周围结构扭曲等。准确性较高，但有少量放射，不宜短期内反复进行。乳腺钼靶与超声检查优缺点：钼靶X线：优点：能准确显示钙化或毛刺，受检查医师的影响小，微小癌、原位癌早期发现的有效方法。缺点：有放射线，一般适用于35岁以上，对乳房边缘的肿瘤易漏诊。乳腺超声：优点：无射线，适于普查、年轻人，小乳房或边缘的肿瘤更有优势，对囊实性鉴别准确，可疑病变动态随访，减少漏诊和误诊。缺点：受检查医师、设备的影响大。因此，对于35岁以下女性，每年应到乳腺专科医生做一次体格检查和乳腺超声检查；35岁以上女性每年都应该进行一次体格检查、超声检查，每一年半到两年进行一次钼靶检查。而对于有结节、包块等疾病的患者则要根据医生的要求定期复查。

乳腺增生是女性最常见的一种乳房疾病，其发病率占乳腺疾病的首位。近年来，乳腺增生的发病率呈逐年上升趋势，发病年龄也越来越低，究竟是什么原因让这么多的女性被乳腺增生所困扰？如何有效预防和治疗这种疾病？乳腺增生和乳腺癌究竟是怎样的关系？在此为您提供科学、专业的指导。肿块或乳痛，你可能患上了乳腺增生 乳腺增生是女性常见的一种乳房疾病，指乳腺上皮和纤维组织增生，乳腺组织导管和乳小叶在结构上的退行性病变及进行性结缔组织的生长。乳腺增生在本质上是一种生理增生与复旧不全造成的乳腺正常结构的紊乱。该病的发病原因在于内分泌紊乱导致的雌激素的过剩和失调。乳腺增生的临床表现主要分为两种情况：乳痛和肿块。首先来说乳痛。乳腺增生所引起的乳痛带有很强的迷惑性，患者不一定是乳房疼。很有可能引起乳头、副乳、腋下、小臂，甚至是后背的疼痛。当疼痛的情况出现在这些部位时，许多女性很少会联想到乳腺增生，而把治疗的对象锁定为疼痛的位置，无法对症下药，影响了疾病的治疗。其次我们来说说肿块，这也是许多女性对乳房进行自检时比较重视的一个方面。但是，乳腺增生的肿块情况比较复杂，目前临床发现的就有块儿状、颗粒状、条索状、片状等许多形状。乳腺增生的肿块带有一定的隐蔽性，有些肿块因为体积原因和位置原因，不易被患者发现。因此，当患者感觉到乳房不适时，应及时到正规医院就诊，以免延误治疗时间。 还有一部分患者临床表现为乳头出现异常分泌物，一旦发生这种情况，很有可能是患上了乳腺增生，切不可掉以轻心。调节饮食防止雌激素过剩临床病例：有个女孩子只有十六岁，两只乳房却大得超过了正常范围。她妈妈讲，孩子体育课都没法上，跑步的时候要用手托着两个乳房跑，女孩乳房上全部都是大大小小的肿块，乳腺增生的情况已经相当严重了， 女孩平时最喜欢吃的是洋快餐。致病原因：雌激素的过剩和失调，是导致女性乳腺增生的根本原因。从以往的经验来看，成熟女性患该病的比例较大，这是因为在35—50岁这个年龄段，正是女性雌激素分泌比较旺盛的阶段。但是，近两年我们发现，乳腺增生的发病率正在往年轻化发展，这与生活环境、饮食结构的变化有直接关系。不客气地讲，现在流行的许多“洋快餐”称得上是导致雌激素过剩的直接原因。包括洋快餐在内的许多肉制品，养殖的鸡、鸭、鱼等，都是用雌激素“催起来”的。这些动物的成长期大大缩短，但“毒性”大大增加。这些美味却危险的食品吃到人的肚子里，在体内积留下来，必然会导致雌激素大量增加，最后诱发乳腺增生。老百姓中有这样一种说法：怀孕和哺乳能够治疗乳腺增生。这种说法并不准确，应该说，怀孕和哺乳能够保护女性暂时远离乳腺增生。因为妊娠期和哺乳期是女性人生中要经历的两个特殊时期，在这段时期内，女性的雌激素会处在一个偏低的水平，从而有效避免了乳腺增生发病的可能。但要想通过这种手段让乳腺增生不药而愈，目前还没有科学依据。解决办法：想要防止雌激素过高，就必须注意饮食，特别是含有动物性雌激素的食品更要远离。例如我们前面提到的洋快餐中的炸鸡、人工养殖的肉类。还有一种深受女性欢迎的食品——蜂蜜，也在此列。根据医学研究证实，蜂蜜、蜂胶、蜂王浆等食品中含有大量的动物性雌激素，大量服用对于女性、特别是患有乳腺类疾病的女性没有好处，所以日常食用时一定要控制好量，千万不要陷入误区。当然，并不是所有的雌激素都会引发乳腺增生，植物性雌激素就是一种对女性健康有好处的激素。这种雌激素主要蕴含在各类豆制品中，例如黄豆、豆腐，多吃一点对女性很有好处。控制情绪避免雌激素失调临床病例：许多患者，一提起自己的乳腺增生就说是被家里人气病的。一位女患者来之前，以为自己得的是乳腺癌，愁眉苦脸、精神不振。首先给她排除了癌的可能，她的脸色一下子就好看了。再往下聊，无非就是家里的一些琐事，丈夫、孩子、同事……她说自己不生气还好，一生气从胸口窜到后背，哪儿都疼。只要告诉她：治你这个病，没有灵丹妙药，心情好了，病自然就减轻了。致病原因：我们常听说一个词：气结——气不畅通就会郁结于胸，最后形成肿块，带来疼痛。所以中医学中有这样一句话：通则不痛，痛则不通。更通俗的解释则是气愤、压抑、闷闷不乐等精神因素会对人体的生理机能产生影响，这其中包括内分泌系统的功能，进而促使一种或几种激素的分泌出现异常，原有的平衡状态被打破，导致乳腺增生的产生。因此对于这种病因，最好的办法就是调整心态，自己给自己的心灵松绑。解决办法：因为生气而导致生病的病例不在少数，通过聊天我发现，无非就是生活中的一些琐事，孩子不争气，婆婆难相处，工作不顺心 ……所以我常说，乳腺增生不仅是一种身体上的疾病，也是一种心理上的疾病，把心结打开了，病自然就好得快了。越是生气，病情就会越严重。每个人的生活都不是一帆风顺的，出现了问题，我们可以想办法来解决，但是身体出了问题，一切工作、生活的基础就没有了。要善待自己，多爱自己，把关注的焦点先放在自己身上，努力做到身体健康、心态平和。其他的事情不妨看淡一点，顺其自然也是一种办法。 除了我们提到的调整心态之外，我们还可以结合活血、化瘀、止痛类的药物来治疗乳腺增生，也包括一些直接作用于细胞，控制雌激素的药剂。通常来说，我们不建议对乳腺增生进行手术治疗，但在以下几种情况下，可以选择手术切除的方法。其一、经检查怀疑有恶变可能的情况下，可以进行手术切除。其二、经穿刺活检，证实出现非典型增生，即发生癌变时，建议手术切除。健康作息保证雌激素平衡临床病例：年轻小姑娘没有精神，眼眶下面带着大黑眼圈，脸蜡黄蜡黄的，在外企工作，压力很大，常常熬夜加班，还时常失眠。难得有休息的时候，却动不动就和朋友在外面通宵喝酒唱歌。最近发现每次来月经之前胸部都肿胀难受得厉害，所以来看病。经过检查她的情况是轻度增生，如果及时注意没什么问题，但是如果继续按照这种方式生活下去，情况就不好说了。致病原因：生活不规律会引起内分泌紊乱、体内激素失调，这是大家都知道的一条医学常识。现代社会节奏快、压力大，这是一个不争的事实，生物钟紊乱、睡眠严重不足、工作负荷过高、不良生活习惯等均会成为雌激素失调的诱因，最后引发乳腺增生。乳腺增生与月经有一定的关联性——女性在进入月经期时，乳小管也在进行更新和剥落，这时乳房的肿痛感会更明显，肿块会更清晰。通常，月经期后这些情况会有所缓解。解决办法：在医学上，并没有对乳腺增生进行分级，我们通常把肿块不明显、疼痛感较轻的情况称为轻度乳腺增生，如果调整及时，这种病症是可以减轻甚至痊愈的。 作为女性，规律的作息时间、健康的生活方式是远离疾病的重要保障。尽可能保证睡眠时间，一日三餐定时定量，调整心态，减轻压力，多吃水果蔬菜，对于防治乳腺增生都起着积极的推动作用。此外，我建议女性朋友必须保持一定的运动量，防止肥胖。因为根据临床研究表明，脂肪在一定情况下可以转化为雌激素，也就是说，肥胖的女性比苗条的女性患乳腺增生的几率要高。还有一些不良的生活习惯，例如抽烟、喝酒等，都应该及时改正，从而减少罹患乳腺增生甚至乳腺癌的可能。乳腺增生：和乳腺癌保持安全距离我们以前常说“闻癌色变”，如今许多女性已经上升到“闻增生也色变”的地步了。很多患者在发现了乳房出现异常之后，一方面讳疾忌医，一方面提心吊胆，一来二去，导致病情更加严重。所以建议女性朋友，如果发现自己的身体出现了异常，一定要及时到正规医院请医生检查。在重视的同时也要学会放松心情，不要自己吓自己。从临床角度来看，由乳腺增生转化成乳腺癌的例子属于少数，据科学统计，大概有3%的乳腺增生患者变成了乳腺癌患者。虽然在导致乳腺癌的高危因素中，“曾患良性乳腺疾病”也赫然在列，但是这个比例是微小的，大可不必因为有了增生就每天生活在患癌的阴影中，这样反而不利于疾病的痊愈。当然，乳腺增生的出现为女性的身体敲响了警钟。患有乳腺增生的女性，应更重视平时的自检和体检，密切留意病情的发展，一旦出现变化，务必及时就医。转载自2008年11月《科学新生活》戚晓东教授访谈

文献综述 卡托普利干预细胞凋亡作用研究进展 卡托普利是第一个口服有效的血管紧张素转化酶抑制剂，自从1981年由美国FDA批准用于治疗高血压以来，卡托普利在治疗充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重构和糖尿病肾病中取得了良好的疗效。它在血管紧张素转化酶抑制剂中应用范围最广[1]。随着相关基础科学的迅猛发展和对卡托普利药理作用研究的深入，近来人们在大量的动物和临床实验中发现卡托普利具有抑制和诱导细胞凋亡的双重作用[2-7]，本文采用文献回顾的方法对卡托普利干预细胞凋亡的作用及相关机制作一综述。1卡托普利的药理作用卡托普利是含有巯基（SH）的血管紧张素转化酶抑制剂,它不但具有其他的血管紧张素转化酶抑制剂药理作用：（1）阻止血管紧张素II(AngII)的生成和作用；（2）保存缓激肽的活性；（3）保护血管内皮细胞与抗动脉粥洋硬化作用；（4）抗心肌缺血和心肌保护作用；（5）增加糖尿病病人对胰岛素的敏感性；（6）阻止心血管病理性重构，而且能通过所含有的巯基清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，起到稳定线粒体膜的作用[8]，此外卡托普利还具有抑制单核巨噬细胞产生肿瘤坏死因子，白细胞介素等细胞因子的免疫学效应[9]。2: 细胞凋亡2.1 细胞凋亡的概念及其基因调控细胞凋亡是指在一定的生理和病理条件下,遵循自身的程序通过启动内部机制,主要是内源性DNA内切酶的激活,从而结束其生命的过程.目前的研究表明，细胞凋亡是基因调控的一种细胞死亡的特殊形式，其调控基因可分为促凋亡基因，包括野生型P53.c-myc，c-fas，c-jun，bcl-bax，ras，IC等基因；抑凋亡基因主要包括Bcl-2和突变型P53。自1972年Kerr[10]等首次提出细胞凋亡概念以来, 细胞凋亡一直是近年来医学界的研究热点.2.2细胞凋亡的通路细胞凋亡的通路主要有两条,一条是死亡受体途径[11]：死亡受体属于肿瘤因子受体(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞内部分含有一个死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配体是一个同源三聚体，每个三聚体分子结合3个Fas分子。一旦与三聚体的配体相结合，Fas通过胞内段的DD和FADD羧基端的DD之间的相互作用，募集胞质中的衔接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas区域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡诱导信号复合体（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增强，而自我剪切活化 。活化的Caspase-8释放到细胞质中即激活Caspase—3，引起细胞凋亡；另一条是线粒体途径[12]：线粒体通路[2]：各种促凋亡信号如DNA损伤、生长因子去除等诱导线粒体释放细胞色素C，在ATP/dATP存在的情况下，细胞色素C结合到Apaf-1的WD40重复区域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-细胞上色素C多聚复合体。此复合体通过Apaf-1的氨基端的CARD与Caspase-9原域的CARD之间的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞质的Caspase—9。Caspase—9酶原之间因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作为起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3促使细胞凋亡。3卡托普利抑制细胞凋亡3.1卡托普利抑制AngII诱导的细胞凋亡AngII对细胞凋亡有重要的影响，但作用机制较复杂，不同的细胞表现出不同的作用：既可以引起细胞凋亡，也可以引起细胞增生[13]，这主要与AngII和其相应的受体AT1，AT2结合所发挥的生物学效应有关。Goldenberg I[14]等实验发现AngII与其相应的受体AT1，AT2结合并共同作用，在增加AT1，AT2受体蛋白的表达的同时并明显上调促凋亡基因的表达，进而激活caspase-3导致细胞凋亡。但亦有研究表明：AT1受体和AT2受体与AngII结合而发挥的作用相反：即AT1受体与AngII结合具有促进细胞增生的作用；AT2受体与AngII结合具有诱导的细胞凋亡作用[15]。这与Liangxuguo[16]等应用卡托普利和氯沙坦干预由AngII所诱导的血管内皮细胞凋亡的实验内结果相一致：氯沙坦作为AT1受体拮抗剂，虽然阻断了AngII与AT1的结合,但对AngII所诱导的细胞调亡无影响，从而说明AT1受体在AngII所诱导的细胞凋亡过程中无明显作用；而使用卡托普利能部分抑制AngII诱导的血管内皮细胞凋亡，其可能机制为卡托普利通过抑制血管紧张素转化酶的活性，阻止了AngI转换为AngII，从而不但使AngII所产生的氧自由基和炎性介质减少，而且部分阻断AngII与其相应受体结合所至的细胞凋亡作用。同时，还能降低促凋亡基因表达，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从分子水平发挥抗细胞凋亡的作用[17]。此外还与卡托普利能减少缓激肽的降解，增加NO的分泌有关[18]。3.2卡托普利抑制氧自由基诱导的细胞凋亡氧自由基可以通过直接损伤DNA，攻击含有酶活性的蛋白质，影响核基因转录，引发脂质过氧化反应等多种途径诱导细胞凋亡。这已经在大量的实验中得以证实。同时，亦有实验证明用抗氧化剂或氧自由基清除剂干预氧自由基诱导的细胞凋亡，能通过阻止P53的激活。下调.BAX的表达和降低Caspase-3的活性而抑制细胞凋亡[19]。而卡托普利本身含有巯基（SH），不但具有抑制微粒体脂质过氧化反应及白细胞产生氧自自由基的作用，而且本身是强有力的氧自由基清除剂 [20]。Tambd[21]等研究发现卡托普利对缺血再灌注过程中产生氧自由基所至的细胞凋亡具有明显的抑制作用，这与我国学者胡青松等[22-23]等研究发现卡托普利具有抑制羟自由基诱导血管内皮细胞、心肌凋亡的结论相一致。由此可见，卡托普利通过抑制和清除氧自由基的双重作用来阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇而激发PT孔开放，同时，卡托普利所含有巯基（SH）可使PT孔处于关闭状态[24]，稳定了线粒体膜电位，阻止Cyt-C及凋亡诱导因子（AIF）从线粒体中释放，阻断细胞凋亡的线粒体途径，从而抑制细胞凋亡。同时卡托普利对线粒体复合体II-III质子泵出速度和电子传递速度升高有调节作用，使质子偶联更紧密，从而保护线粒体的呼吸功能，改善细胞的能量代谢[25]，有效阻止氧自由基所造成的细胞内钙超载。3.3卡托普利阻止缓激肽降解而抑制细胞凋亡实验证明卡托普利能通过减少缓激肽的降解，使增加的缓激肽通过与其β2受体结合,进而激活磷酸酯酶C(PLC),产生的IP3使细胞内Ca2+释放而一氧化氮合酶（NOS）和上调ecNOS，从而增加一氧化氮（NO）的产生[26]。NO对细胞具有双重作用，即在通过产生氧自由基介导细胞凋亡的同时，可以通过抑制Caspase酶活性而产生抗细胞凋亡作用，作用结果与细胞类型和NO的量有关[27]。Dimmelers[18]等实验证明NO能通过抑制Caspase酶活性而阻断AngII所致的细胞凋亡作用，但Fukuok [28]等实验发现NO能通过上调Fas及Bax的表达而介导细胞凋亡。因此我们可以认为卡托普利可能一方面通过适当增加NO水平，另一方面通过其所含有巯基（SH）而清除过量的NO产生的氧自由基而共同发挥抗细胞凋亡的作用。此外，通过缓激肽-NO 途径可以激活蛋白激酶C，降低细胞代谢水平，降低ATP及氧的需求，改善细胞的能量代谢，阻止细胞凋亡[29]。3.4 其他最近研究发现卡托普利能阻断由Fas受体介导细胞凋亡：UhalBD[4]等研究发现卡托普利通过降低肺泡上皮细胞表面的Fas和其配体（Fasl）的表达而抑制凋亡。此外Odakac Mizuochi T[30]等证实卡托普利通过干扰外周T细胞表面的Fas和Fasl之间的相互作用，并能降低凋亡过程中产生的Caspase-3类似物的活性而抑制凋亡。这为我们研究卡托普利在自身免疫病的应用开辟了新的道路。4卡托普利诱导细胞凋亡已有实验证明卡托普利具有促进细胞凋亡的作用，Buemi M[5]等发现在实验中卡托普利0.23mg可以引起血管平滑肌细胞凋亡数目增加，同样Anne Mette[6]等动物模型中发现卡托普利通过诱导血管平滑肌细胞凋亡而抑制受损伤后血管内膜的增生狭窄。这其中的具体机制还不清楚，可能是卡托普利能降低心肌梗死后血管内膜AngII的AT1受体的mRNA的表达[31]，从而引起AngII与AT1结和所致的细胞增生及抗凋亡作用减弱，而与AT2 受体结合所致的细胞凋亡作用增强的结果[32-33]。此外Ohwada T[34]等研究发现对大鼠血管拉伤后给予血管紧张素转化酶抑制剂治疗，不但可以明显增加新生内膜ecNOS的表达,同时也可上调iNOS的表达，导致NO产生过多，而过多NO能通过上调Fas及Bax的表达，下调Bcl-2的表达诱导平滑肌细胞凋亡[28]。近来Glzzerman I[7]等在临床上应用ACEI治疗肾移植术后病人发生的红细胞增多症取得了成功，并阐明其作用机制为ACEI能诱导肾移植术后病人Fas及其接头蛋白FADD的mRNA表达增加,上调其蛋白表达，但对BCL-2.Bcl-xl.Bax,caspase-8.caspase-3的表达无影响，从而通过激活死亡受体途径诱导祖红细胞凋亡。由此可见，卡托普利对细胞凋亡所具有促进的作用无疑有利于治疗冠状动脉手术后的内膜增生和再狭窄，同时也为其治疗IgA肾病及糖尿病肾病提供了新的理论基础。问题和展望综上所述，卡托普利具有抑制和诱导细胞凋亡的双重作用。但目前的问题是卡托普利为什么会产生两种截然不同的药理作用。我们推测这主要取决于细胞类型，卡托普利的剂量以及机体所处病理状态等因素，但具体的机制有待进一步研究。总之，卡托普利干预细胞凋亡的作用已经得到了共识：卡托普利通过阻断AngII与其受体之间的作用，减少氧自由基的产生，调控NO的合成，干扰Fas和Fasl之间的相互作用来激活或阻断细胞凋亡程序，从而抑制或促进细胞凋亡。我们有理由相信：通过对卡托普利抗细胞凋亡作用深入研究，无疑为探讨充血性心力衰竭，缺血再灌注损伤以及冠状动脉粥样硬化及手术后的再狭窄等带来突破，并可推动心血管疾病诊断及治疗的发展。参考文献1 苏定冯 心血管药理学(M) 第一版 北京 科学技术出版社 2001,241-2492 LihlSuzukj J, Bayna E，Zhang FM et，al。Lipopolysaccharide induces apoptosis in adult rat ventricular myocytes via cardiac AT（1） receptors Am J，Physiol heart circ physiol 2002 ; Aug：283（2）：H461-73 Deaso ，Dumont C，Mollereau B et . al. Thiol-mediated inhibition of Fas and CD2 apoptotic singaling in activated human peripheral T cells Int，Immunol，1997.9：117-254 Uhal BD ，Gidea C，Bargout R et al.Captopril inhibits apoptosis in human lung epithelial cells a potential antifibrotic mechanism Am，J，Physoil. 1998：275：1013-75 Buemi M ， Allegra A，Marino D et al .Does captopril have a direct proapoptotic effect Nephron 1999,JAN;81(1):99-1016 Anne Mette ，Holm Claus Bogelund ，Peter Riis Hansen et al. ACE-inhibition promotes apoptosis after balloon injury of rat carotid arteries Cardiovascular Research , 2000;(45):777-7827 Glzzerman I,Patel H, Glicklich D et al .Angiotensin-coverting enzyme inhibition induces death receptor apoptosis pathways in erythoid precursors following renal transplantation. Am J Nephrol.2003 jul-Aug :23(4):195-2018 Constantinescu CS ,Goodman DB, Pauls H et al.Captopril and lisinopril suppress production of interleukin-12 by human peripheral blood mononu clear cells Immol letters 1998,62:25-319 Jay D Captopril and glutathione inhibit the superoxide dismutase activity of Hg(II) Arch Inst Cardiol Mex.1998,68:457-6110 Kerr JF, Wyllie AH ，Currie AR Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics Br J cancer 1972，26（4）：239-5711 Ashkenazi A ,Dixit VM，Death receptors：singnaling and modulation （J） Science 1998，281（28）：1035-4112 Cain K ,Bratton SB ,Langlais C et al Apaf-1 oligomerizes into biologically active approximately 700-KDa and inactive approximately 1.4-MDa appoptsome complexes （J） Biol，chem ：2000：275（9）：6067-607013 Diep QN, EI Mabrouk, Yue P et al Effect of AT(1) receptor blockade on cardiac apoptosis in angiotensinII induced hypertension.Am J Physiol Heart Circ Physiol ,2002-May;282(5)H1:635-4114Goldenberg I,Grossman E ,Masaki H et al Angiotensin II induced apoptosis in rat cardiomyocytes cuture opossible role of AT1 and AT2 receptors J Hypertension 2001 Sep:19(9):1681-915 Mccarthy NJ ,Benett MR, The regulation of vascular smooth muscle cell apoptosis Cardiovase Res,2000,45(3): 747-75516 Liang xu guo, Hou gui hua,,Pan qi xing Effect of AngiotensinII captopril and losartan on apoptosis in vascular endothelial cells Juournal of ShanDong university ，2002：（40），44：300-30417 梁绪国，潘其星 氯沙坦和卡托普利合用对凋亡基因调控的影响。国外医学：心血管疾病分册：2003;3:30卷（2）：112-11518 Dimmerler S ,Rippmannn V，Weiland U et al .AngiotensinII induces apoptosis of human endothelial cells protective effect of nitric oxide circ Res 1997，81：970--97619 Oskarsson J, Coppy ,Weiss R et al Antioxidants attenuate myocyte apoptosis in the remote non-infarcted myocardium following large myocardial infarction (J) Cardiovasc Res.2000.45(3):679-68720 Sogaard P,Klausen IC, Rungby J et al Lipoprotein(a) and oxygen free radicals in survivors of acute myocardial infarction effects of captopril Cardiology 1996 .87(1):18-2221 Tamba M ，Torreggiani A. Free radical scavenging and copper chelation：a potentially beneficial action of captopril . Free Radic Res，2000，32（3）：199-21122 胡青松，罗伟 ,程晓署外源羟自由基诱导血管内皮细胞凋亡及卡托普利的干预作用.江西医药。2002 ，37：（2）95-9823罗伟，姜醒华,罗伟 羟自由基诱导血管内皮细胞.心肌细胞凋亡及卡托普利的干预作用 江西医学院学报 2001，41（2）136-13924 Vieira HL,Dorge H The mitochondrion:desive for cell death control ? signaling pathway in aooptosis Cell Death Differ 2000：7（12）：114625 苏晓华，姜晓林 卡托普利对缺血再灌注心肌线粒体电子-质子偶联和氧化磷酸化的影响。中国病理生理 1996，12（3）：316-31826 Matsumoto N, Mannabe H ,Ochiai J et al An AT1 receptor antagonist and angiotensin-coverting enzyme inhibitor in hunan aortic endothelial cells throught upregulation of endothelial cell nitric oxide synthase activity . Shock 2003 Jun:19(6):12(3):316-31827 Stefanelli C , Pignati C ,Tantini B et al. Nitric Oxide can function as a killer molecule or antiapoptotic efector in cardiomyocytes Biochim Biophys Acta 1999,1450:406--1328 Fukuo K, Hata S ,Sohara T et al .Nitric oxide induces upregulation of fas and apoptosis in vascular smooth muscle Hypertension, 1996; 27:823-2629 Yoshida H,Zhang JJ ,Chao L et al Kallikrein gene delivery attenuates myocardial infrarction and apoptosis after myocardial ischemia and reperfusion Hypertension 2000;35:25-31 30 Odaka C ,Mizuochi T Angiotensin-converting enzyme inhibitor captopril prevents activation-induced apoptosis by interfering with T Cell activaton signals Clin Exp .2000.Sep;121(3):515-2231 Zhang Gx ,Pu Sy ,Yang Yz et al. Effect of losartan and captopril on expression of cardioc angiotensinII AT1 receptor mRNA in rats following myocardial in farction Zhongguo Yao Li Xue Bao.1997 sep;18(5):431-41232 Yamada T ,Akishita M,Pollman MJ et al .AngiotensinII type 2 receptor mediates vascular smooth muscle cell apoptosis and angiotensinII type 1 receptor action: an in vitro gene transfer study life .Sci 1998:63 :289-29533.Tea BS,Der PB, Sarkissian S et al Proapoptotic and growth-inhibitory role of angiotensinII type 2 receptor in vasucar smooth muscles cell of spontaneously hypertension rats in vivo Hypertension 2000,May,35(5):1069-73 34 Ohwada T, Ishibshi T ,Yaoita H et al .Different contribution of apoptosis to the antiproliferative effects of L-arginine.enalapril and losartan on neointimal growth inhibition after balloon arterial injury Circ J2002 Oct :66(10):965-71立题依据缺血再灌注损伤不但是心血管疾病中一种常见的病理现象，而且也是导致血管内皮细胞过度凋亡的主要原因之一；而细胞凋亡是缺血再灌注损伤的特征之一，细胞凋亡的多少决定了缺血再灌注损伤的轻重。故研究内皮细胞细胞在缺血再灌注损伤时凋亡的发生机制和利用药物来抑制VEC在缺血再灌注损伤所致的凋亡成为心血管研究领域中的重点课题。 缺血预处理（ischemic preconditionging，IPC）是体内最强大的保护机制，是一种多元性细胞防御现象[1]：即预先反复短暂缺血可延缓或减轻组织后续缺血再灌注损伤的现象。而IPC的保护作用之一便是通过抑制缺血再灌注损伤后缺血区存活的心肌和血管内皮细胞发生可逆或不可逆坏死或凋亡来体现的[2]。诱导预处理的因素从早期的缺血、缺氧、快速起搏和热应激到现在的药物预处理。但由于缺血本身是一种损伤，实施损伤性预处理由于伦理观念临床上还难以接受，故诱导预处理的研究已从缺血、生物、物理、化学源性扩展到药物性预处理（pharmacologic preconditioning）即通过药物激发或模拟机体内源性物质呈现的心脏保护作用。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）具有药物预处理作用。目前研究表明， IPC对心脏的保护作用具有双时相性，即：心脏保护作用在2-3个小时后消失的早期或经典预处理；和反复短暂缺血后20-24小时缓慢出现的晚期预处理或延迟性保护作用或第二保护窗口。预处理的早期保护作用时间窗较窄，必须在缺血再灌注损伤前给予，故临床可操作性不强，相反，晚期预处理作用时间跨度大，在临床运用时更有可行性和便利性，因此，更具实用价值和开发意义。而且ACEI通过诱导或增强预处理早期心脏保护作用已有较多研究，而诱导预处理的延迟保护作用的报道不多，而且大多数ACEI为前体药，需要在体内代谢后才具有生物活性。而卡托普利是非前体药，具有生物活性，因此在我们的研究中，采用了卡托普利。IPC保护作用不仅存在于器官水平，而且存在于细胞水平；已有研究证明药物预处理是通过药物激发或模拟机体内源性物（腺苷，缓激肽，降钙素基因相关肽，前列环素（PGI2），一氧化氮（NO）等），而呈现的保护心肌和血管的作用。其研究方法也是通过模拟IPC而建立起来的，而我们采用模拟IPC而建立起来的前期实验已经证明卡托普利对内皮细胞进行晚期预处理后进行缺氧复氧损伤，结果发现细胞的凋亡现象明显减轻，从而证明卡托普利对缺氧复氧损伤导致的内皮细胞凋亡具有延迟保护效应，使细胞凋亡减少，并且在本实验所规定的浓度范围内，随着卡托普利浓度的增加此保护作用渐增强。但应用HOE140阻断剂、PKC阻断剂、NOS阻断剂和NF-kB阻断剂，分别与卡托尽管作普利共同孵育细胞,再对内皮细胞行H/R损伤，可见卡托普利对H/R损伤导致内皮细胞凋亡的晚期保护效应部分消失。证明卡托普利是通过激活缓激肽B2受体、PKC途径、NOS合成以及核因子的转录过程，保护内皮细胞，抑制细胞凋亡的，但其具体作用靶点仍有待于进一步的研究。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族目前被认为是与凋亡最为密切相关的一类蛋白酶，凋亡的发生是细胞中Caspase家族凋亡蛋白特异性活化的结果。其中Caspase-3、Caspase- 8、Caspase-9在细胞凋亡经典途径中的重要凋亡蛋白，在凋亡过程中起着关键作用，而目前对卡托普利预处理与Caspase蛋白表达的关系研究在国内外报道均未多见，故本实验根据以往的研究结果，采用免疫组化的方法来检测Caspase-3、Caspase- 8、Caspase-9的蛋白表达来探讨以下问题：1 缺氧/复氧损伤诱导血管内皮细胞凋亡途径的研究。2.ACEI晚期预适应抑制缺氧复氧诱导血管内皮细胞凋亡的作用靶点。以进一步明确缺血再灌注损伤和ACEI晚期预适应抑制细胞凋亡的的相关机制，为临床应用提供新得理论基础和治疗靶点。内 容 提 要缺血再灌注损伤可以导致内皮细胞结构改变和功能失调，进而引起细胞发生一系列变化，例如细胞内钙离子超载、脂质过氧化反应增加、大量自由基产生、细胞膜通透性增强、蛋白含量降低等变化，最终引起细胞死亡或凋亡。自从1986年Murry等首次发现预处理现象至今，缺血预适应（IPC）的机制尚不十分明确，但多年的研究明确证实，IPC是最强大的内源性保护机制，其心脏保护作用主要表现在限制心梗范围，减少恶性心律失常的发生和改善心功能等。药物预处理研究的发展，避免了缺血的损伤，更符合医学论理学。近年来发现，IPC及其药物预适应对缺氧再灌注损伤的血管床亦有保护作用。但无论是缺血还是药物预适应，特别是晚期预适应，其研究的重点多集中于对心肌细胞的保护，而对内皮细胞与缺血再灌注损伤的研究、预适应特别是晚期预适应保护内皮细胞免受缺血再灌注损伤的研究还不多见，仅少数实验涉及此方面的研究，相关文献报道较少用。在实验中，我们通过建立血管内皮细胞缺血再灌注（缺氧复氧）损伤模型,以探讨ACEI预适应对血管内皮的延迟保护作用及其机制。实验研究结果显示：1. 缺氧复氧损伤引起血管内皮细胞凋亡的病理过程中，caspase-3,9被激活，并且随着复氧时间的延长，caspase-3，9表达逐渐增加，提示caspase-3,9参与了缺氧复氧损伤诱导血管内皮细胞凋亡的病理过程；同时caspase-8表达在这个过程中无明显变化，因而我们可以从中推测缺氧复氧损伤导致血管内皮细胞凋亡主要是通过线立体途径进行的。2. 卡托普利预处理组的Caspase表达变化与缺氧/复氧组相似，但明显下降,有此可见，卡托普利预处理可以通过影响缓激肽B2受体、一氧化氮产生等多种途径来降低caspase-3,9的表达来抑制细胞凋亡而发挥血管内皮的保护作用, 且此保护作用具有剂量依赖性。由此可见，卡托普利预处理对血管内皮的保护作用涉及多种机制。这对于维持血管内皮细胞的屏障功能和内分泌功能，减轻缺血后的炎症反应，维持血流稳定和血管的紧张性调节具有重要意义。本研究将进一步阐述卡托普利的作用机制，为其临床应用提供新的作用空间。关键词：细胞凋亡 卡托普利 Caspase-3,8,9 缺血再灌注损伤第一部分：缺氧/复氧损伤诱导血管内皮细胞凋亡途径的研究前言细胞凋亡是细胞的程序化死亡，是由一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶（caspase）级联反应（cascade）事件的结果，而caspase-3又被证实处于该级联反映的下游，是凋亡的真正执行者； caspase-8,9又分别做为细胞凋亡的两条主要途径中caspase-3的激活剂，故三者在细胞凋亡中起着重要作用。而缺血在灌注损伤不但是心血管疾病中一种常见的病理现象，而且也是导致血管内皮细胞凋亡的主要原因之一，目前关于缺血再灌注损伤诱导细胞凋亡的研究多集中于神经元细胞和心肌细胞，对血管内皮细胞的凋亡机制了解不是很多。而且，缺血再灌注损伤可引起细胞凋亡已在大量实验中得以证实，故本实验对此不在重复，重点是通过对培养的人脐静脉内皮细胞进行缺氧/复氧来模拟缺血再灌注损伤这一病理过程，并采用免疫组化的方法检测caspase-3,8,9的表达，来进一步探讨和阐明缺血再灌注损伤导致细胞凋的相关机制和caspase3,8,9在细胞凋亡中所起的作用。1 材料与方法1.1实验材料1.1.1实验仪器 二氧化碳培养箱(RAK 日本) 倒置相差显微镜(OLYMPUS公司) 恒温水浴箱(H2S-H 哈尔滨) 加样器(Labsystem芬兰)显微镜自动暴光系统（（OLYMPUS pm20）超净工作台（SW-CT-EFD苏州）低温台式离心机（AERMLE Z383K 德国） 1.1.2实验药品与试剂人脐静脉内皮细胞株（购置中国科学院上海细胞库）caspase-3,8,9单克隆鼠抗人抗体（Santa Cruz）辣根过氧化物酶兔抗鼠抗体（Santa Cruz）胰蛋白酶(trypsin)购自Difco公司.高压氮气一瓶（上海比欧西气体工业有限公司）胎牛血清和DMEM合成培养基购自Gibco公司。将干粉型DMEM培养基10g溶于三蒸水1000ml，在磁力搅拌器上混匀，过滤除菌，分装于250ml盐水瓶中4C保存。胎牛血清首次应用时先56℃灭活30min。用时现配制成含15%胎牛血清的DMEM：取胎牛血清15ml, HEPES（1mmol/L）1ml，L谷氨酰胺（0.2mmol/L）1ml, 抗菌素液(青霉素10,000U/ml链霉素10,000g/ml)1ml, 加入DMEM82ml,然后用7.5%NaHCO3调PH至7.4。配制无血清DMEM：DMEM 96ml，加入HEPES、L谷氨酰胺、抗菌素液各1ml，然后用7.5%NaHCO3调PH至7.4。HanK’s缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·12H2O 0.13g，Na2CO3 0.35g，CaCl2 0.14g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖·H2O 10.9g，加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO3调PH至7.4，过滤除菌，250ml瓶分装，4℃保存。D-HanK’s缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·12H2O 0.13g，Na2CO3 0.35g，加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO3调PH至7.4,高压除菌，250ml瓶分装，4℃保存。PBS缓冲液: NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.5g,加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO3调PH至7.4，过滤除菌，250ml瓶分装，4℃保存。缺氧液：Na2HPO4:0.9mmol/L；NaHCO3:6.0mmol/L ；CaCl2：1.8mmol/L；MgSO4:1.2mmol/L;乳酸钠:40mmol/L;HEPES:10mmol/L; Nacl:98.5mmol;KCl:10.00mmol/L加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO3调PH至7.4，过滤除菌，250ml瓶分装，4℃保存。复氧液：Na2HPO4:0.9mmol/L；NaHCO3 ：20.0mmol/L ；CaCl2 ：1.8mmol/L；MgSO4:1.2mmol/L；glucose:55mmol/L；HEPES:10mmol/L; Nacl:129.5mmol；KCl:5.0 mmol/L加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO3调PH至7.4，过滤除菌，250ml瓶分装，4℃保存。1.2 实验方法1.2.1人脐静脉内皮细胞的培养（1）体外培养的人脐静脉内皮细胞形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。（2）2-3d换液一次。换液时将原培养液弃掉1/2-2/3，然后加入新鲜的培养液至原来的量。待细胞长至融合状态后，即可传代。（3）原代培养的细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的D-Hank’s液清洗2次。加入0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞覆盖，室温（20-25℃）下消化1-2min。（4）镜下见细胞稍收缩变圆、细胞间隙增宽后，立即翻转培养瓶，弃酶液。可再用D-Hanks液轻轻洗1次。加入IMDM培养液（pH7.2、100IU/ml青霉素、100g/ml链霉素）和10%胎牛血清。（5）用弯头吸管吸取培养液，轻轻将细胞吹打下来。调整细胞密度至大约1.5×105个/ml。按实验需要接种到新的培养瓶或其他培养皿中。一般按1：2或1：3的比例传代（即1瓶传2-3瓶）。（6）内皮细胞多次传代后，其形态和生物学特性会有所改变，故不宜做长期传代培养。如实验需要可重复从原代建立培养。因此，一般不做冷冻和复苏处理。1.2.2 台盼蓝染色细胞记数 细胞记数对于决定植入的细胞浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度都是极为重要的。首先取待测的细胞悬液0.1ml加D-Hank’s0.8ml及0.3%台盼蓝0.1ml（死细胞着色），混合后滴入血球记数盘内，按白细胞记数法，于低倍镜下计数4角的4个大格内的活细胞数（透明未着色者），然后按下式记数：细胞浓度（细胞数/ml）=（4个大格内的活细胞数/4）×104×稀释倍数（10）细胞存活率=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%1.2.3缺氧复氧模型的建立取培养至第3代的人脐静脉内皮细胞用缺氧液换液，95%氮气、37℃培养不同时间后，再以复氧液全量换液，并恢复5%CO2气体环境正常培养，建立缺氧复氧模型。1.2.4实验分组与方案 实验随机分两组：（1）对照组（C）：细胞置IMDM培养基中于5%CO2、370℃饱和湿度培养箱培养 （2）缺氧复氧组（H/R）：细胞于缺氧液、100%氮气、37℃条件下培养2小时后，全量换以复氧液，并恢复5%CO2气体环境分别培养1小时，2小时，3小时，4小时。1.3 Caspase—3，8，9表达测定：采用免疫组化染色的方法：收集以上各组细胞，于4℃多聚甲醛固定后过夜，再用0.5%H2O2—甲醇液处理30分钟（封闭细胞内源性过氧化物），再浸入到PBS中洗3×5分钟，滴加5%—10%的正常动物血清，室温，放湿盒中封闭30分钟，滴加一抗，湿盒内4℃过夜，再浸入到PBS中洗3×5分钟，滴加二抗，37℃，30分钟，浸入到PBS中洗3×5分钟，加入避光显色5—10分钟（室温），光镜下控制反应强度（棕色），浸入到PBS中洗3×5分钟，终止反应，经80%，90%，2×100%乙醇溶液脱水，二甲苯透明，每步1分钟，室温放置数分钟，使二甲苯完全蒸发掉，最后滴加1滴封片液。1.4 细胞记数：在培养孔边缘统计学分析和中心之间的位置随机选取4个区域进行细胞记数并取平均值，每个区域记数约200个细胞，每组有4个平行孔，计算阳性细胞占细胞总数的百分比.1.5统计学分析各种计量数据均以均数±标准差表示，各组数据间显著性检验采用t检验，多个样本均数比较及两两比较采用ANOVA，统计学分析应用SPSS软件包。P<0.05为差异有显著性。2结果2.1对照组的Caspase蛋白表达：对照组的细胞染色均很微弱，说明正常条件下Caspase-3,8,9的蛋白基本无明显表达，表明Caspase-3,8,9在正常条件下活性低下。2.2缺氧复氧组的Caspase蛋白表达：与对照组相比,缺氧/复氧组中检测Caspase-3,9蛋白表达的细胞的染色明显，各组相比P<0.05差异有统计学意义这说明缺氧/复氧损伤使血管内皮细胞的Caspase-3,9蛋白表达明显增加，；而检测Caspase-8蛋白表达的细胞染色无明显染色，各组相比P>0.05差异无统计学意义，这说明Caspase-8在缺氧复氧损伤中没有明显表达，即没有参与这一病理过程。2.3Caspase蛋白表达的时间依赖性：缺氧复氧组的血管内皮细胞Caspase-3,9的表达随着复氧时间的延长而进一步增加直到复氧四小时而达到顶峰。（表1）（附图1）Table1 Changes of caspase-3.8.9 expression on HUVEC induced by hypoxia/reoxygenation groupCaspase expression positive cells % Caspase-3 casepase-8 casepase-9Control group 5.6±1.2* 3.3±1.4 6.4±2.2*hypoxia/reoxygenation1.0h 12.8±2.4* 3.2±2.2 22.6±2.4*hypoxia/reoxygenation2.0h 20.5±3.2* 3.6±2.6 32.8±1.8*hypoxia/reoxygenation3.0h 38.8±2.2* 3.5±2.1 42.2±3.2*hypoxia/reoxygenation4.0h 47.2±2.6* 3..8±1.6 52.8±2.6*The expression of caspase-3,8,9 were detected by immunocytochemistry. the Caspase-3、9 were activated in HUVEC during hypoxia /reoxygenation and expression of caspase-3,9 were significantly increased fol lowed the time of reoxygenation extending;but expression of caspase-8 have no changes in HUVEC during hypoxia/ reoxyge nation.3.讨论缺血和缺氧有着极其相似的病理改变和发病机制，故设计利用培养的人脐静脉内皮细胞的缺氧复氧模型来模拟缺血再灌注损伤模型，旨在研究缺血再灌注损伤导致细胞凋亡的可能机制及Caspase家族相关的蛋白酶的表达变化。为了更好的模拟在体时细胞的缺血再灌注状态，在缺氧时我们采用缺氧液培养细胞，除造成缺氧外，同时限制糖，钙及液体量，而在复氧时则用含糖，钙的复氧液，并给予充分的氧，以满足再灌注的条件。在本实验中，我们发现在对照组的HUVEC的Caspase-9仅低水平表达，但实验组在缺氧两小时后再进行复氧的过程中，在复氧早期Caspase—9，表达即开始增加，并随着复氧的时间的延长而逐渐增加，在复氧四小时达到顶峰。这无疑提示Caspase—9在缺氧/复氧诱导HUVEC凋亡这一病理过程中被激活并参与了这一病理过程。细胞凋亡是由于细胞程内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起细胞主动死亡的过程，这一过程一般要经历启始阶段、效应阶段和降解阶段（Initiation phase、Effect phase and Degradation phase）三个阶段[3]。启始阶段时，细胞受到来自外界的各类凋亡信号的刺激以引发细胞内一系列生化反应；效应阶段时，细胞内进行各种生化反应而形成细胞凋亡的一条或数条信号传导通路，其中包括必须的四大关键元件：线粒体，Caspase ，bcl-2s和Apaf-1。最终细胞进入降解阶段时，多种水解酶（包括特异性蛋白酶Caspase 和核酸酶）被活化，细胞内表现为DNA的降解，细胞质和细胞核浓缩，细胞体积缩小，质膜发泡，最终细胞裂解，凋亡小体形成并被周边吞噬细胞吞噬降解。由此可见，Caspase家族在细胞凋亡中发挥着极为重要的作用。Caspase家族的分子量在30-50KD之间，包括三个结构域：氨基端的原域、大亚单位（约20KD）、和小亚单位（约10KD）。根据它们之间大小亚单位序列的同源性以及功能，可分为三组[4]：（1）细胞因子处理组：Caspase-1、-4、-5、-11、-12、-13和-14；（2）凋亡起始组：Caspase-2、-8、-9和-10（3）：凋亡效应组：Caspase-3、-6和-7。细胞因子处理组和起始组Caspase酶原都含有较长的原域，长原域中包含有死亡效应域（DED）或Caspase募集域（CARD）。DED和CARD的结构与死亡域(DD)相似，都属于死亡域超家族。这些区域通过蛋白-蛋白的相互作用从而在Caspase酶原的激活过程中发挥重要作用。相比之下，效应组Caspase的原域很短，不可能通过这种方式激活。除此之外，Caspase还具备以下特点（1）：它是一种半胱氨酸蛋白酶，用半胱氨酸作为裂解底物的亲核集团（2）：其催化活性对底物的天冬氨酸有特异的要求，既催化时使底物的天冬氨酸残基羧基端的肽键断裂（3）：Caspase以活性很低的酶原形式合成，通过蛋白酶水解去处氨基端的一段序列而被激活。（4）：活化的Caspase能够特异性地水解一套底物，从而导致细胞凋亡，此过程为不可逆反应。（5）：正常情况下，细胞内Caspase与其抑制剂总是共存的，以免Caspase酶原被意外激活，对正常细胞造成损伤。正是这种Caspase家族组成的复杂性和独特的生物学特性才决定了不同的细胞含有不同的Caspase群体，不同的刺激激活不同的细胞凋亡信号传导途径，由不同的Caspase参与信号的级联放大反应，故发生细胞凋亡的机制也不尽相同。在本实验中，我们还发现在复氧早期Caspase—3蛋白表达即开始增加，并随着复氧的时间的延长而逐渐增加，在复氧四小时达到顶峰。这无疑提示Caspase—3在缺氧/复氧诱导HUVEC凋亡这一病理过程中被激活并参与了这一病理过程。这与[MatsushitaH] [5]所进行的缺氧诱导内皮细胞凋亡时实验结果相一致。Caspase-3基因（CASP-3）最初在人类Jurkat-T淋巴细胞中被克隆出的，该基因编码一个分子量为32KD的半胱氨酸蛋白酶CPP32，其活性中心和结合底物相关的保守氨基酸序列均与白细胞介素—Iβ转化酶（IEC）一致。其后，等研究发现CPP32酶原含有凋亡素，它由分子量为17KD和12KD的大小2个亚基组成，[Nicholson]等把它命名为Caspase-3[6]。在Caspase-3酶原中存在一安全扣调解三肽，由“Asp-Asp-Asp”组成，位于大小亚基结合处可变形的环区中，凋亡发生时该三肽残基在胞浆内被酸化裂解，在Caspase-3的触发活化是起关键作用，因而它可能是整个凋亡级联反应的一个关键调节点[7] 。正常情况下，Caspase-3是以休眠状态的酶原形式存在于正常细胞中，酶原的N端有一前区（prodomain），与Caspase-8、9等起始型Caspase相比，其前区较短，不含有DED，必须在起始型Caspase被激活后才能进一步被激活[8]。Caspase-3的激活主要是通过两条细胞凋亡途径进行的：1死亡受体途径[9]: 死亡受体属于肿瘤因子受体(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞内部分含有一个死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配体是一个同源三聚体，每个三聚体分子结合3个Fas分子。一旦与三聚体的配体相结合，Fas通过胞内段的DD和FADD羧基端的DD之间的相互作用，募集胞质中的衔接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas区域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡诱导信号复合体（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增强，而自我剪切活化 。活化的Caspase-8释放到细胞质中即激活Caspase—3；2：线粒体通路[10]：各种促凋亡信号如DNA损伤、生长因子去除等诱导线粒体释放细胞色素C。在ATP/dATP存在的情况下，细胞色素C结合到Apaf-1的WD40重复区域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-细胞上色素C多聚复合体。此复合体通过Apaf-1的氨基端的CARD与Caspase-9原域的CARD之间的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞质的Caspase—9。Caspase—9酶原之间因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作为起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3。Caspase—3激活时在Asp（pl）-x位置切开，形成大小亚基（α和β），同时去掉其N端的前区，进而α与β结合形成异二聚体（17KD-12KD）[11]，酶的两个活性位点位于大小亚基的结合部，异二聚体还将进一步通过次级键形成四级结构（α/β）2发挥作用。Caspase酶原被剪切而发挥作用时，其辨认序列从N端到切割位点至少要4个氨基酸，而且P1位点必须是Asp（D）。一旦Caspase—3被激活，其本身至少从三个方面导致细胞凋亡[11]：（1）分解凋亡保护蛋白，如凋亡抑制性蛋白bcl-2家族（2）直接解聚细胞结构，如分解细胞骨架蛋白（α-spectrin, β-spectrin,actin,tau蛋白等）和调节细胞骨架的蛋白gelsolin。（3）使细胞内参与DNA复制和修复的蛋白酶失活或下调，而且激活其他的Caspase并且放大Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。同时我们还从实验中发现Caspase—8的表达在缺氧/复氧诱导细胞凋亡的整个过程中，无明显变化，这说明Caspase-3的激活主要是通过线粒体途径由Caspase-9激活的，而不是通过细胞的死亡受体途径由Caspase-8激活的。这也进一步说明缺氧/复氧导致内皮细胞受损时，氧自由基大量产生和细胞内钙超载等多种机制引起线粒体的跨膜电位崩解，激发了细胞凋亡的线粒体途径而导致细胞凋亡。4.结论 在缺氧复氧损伤诱导HUVEC凋亡的过程中， Caspase-3，-9蛋白表达明显增加，并随着复氧的时间的延长而逐渐增加，在复氧四小时达到顶峰。这说明Caspase-3， Caspase—9参与了缺氧/复氧诱导HUVEC凋亡这一病理；同时Caspase—8的蛋白表达在缺氧/复氧诱导细胞凋亡的整个过程中，无明显变化，从中我们可以推测缺氧/复氧诱导血管内皮细胞凋亡主要是通过线粒体途径进行的。第二部分 ACEI预适应对缺氧复氧诱导血管内皮细胞凋亡时caspase-3,8,9的影响及机制前言 IPC作为体内最强大的内源性保护机制，在缺血再灌注损伤中的作用已是不争的事实，IPC的保护作用不仅存在于器官水平，而且存在于细胞水平；不仅可以保护心肌细胞，还可以保护内皮细胞。然而，缺血本身是一种损伤，实施损伤性预处理由于伦理观念临床上还难以接受，故药物性预处理具有重要的研究价值。卡托普利是第一个口服有效的血管紧张素转化酶抑制剂，自从1981年由美国FDA批准用于治疗高血压以来，卡托普利在治疗充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重构和糖尿病肾病中取得了良好的疗效。它在血管紧张素转化酶抑制剂中应用范围最广[13]。随着相关基础科学的迅猛发展和对卡托普利药理作用研究的深入，近来人们在大量的动物和临床实验中发现卡托普利具有药物预处理的作用。 缺血再灌注损伤不但是心血管疾病中一种常见的病理现象，而且也是导致血管内皮细胞过度凋亡的主要原因之一，这已在大量的实验中得以证实，但对其发生机制的阐明还缺乏明确阐述。而且关于缺血及再灌注时细胞凋亡机制的研究,目前主要集中在神经细胞和心肌细胞,对VEC的研究较少。此外血管内皮细胞作为一个具有多种生物活性的器官，具有重要的生理功能，内皮细胞凋亡过度既是内皮细胞功能失调的始动环节，也是冠心病发生和发展的细胞学基础，也是不稳定型心绞痛、急性心肌梗死等急性心脏事件的促发环节，而且还能抑制心脏急性缺血后的血管再生，妨碍其功能的恢复。故研究缺血再灌注损伤导致VEC发生凋亡的机制,明确有效的阻断位点并加以阻断,对保护VEC,治疗缺血缺氧性疾病有重要的理论和现实意义。本实验通过建立血管内皮细胞缺血再灌注（缺氧复氧）损伤模型,探讨ACEI预适应对血管内皮的延迟保护作用机制，为其抗缺血再灌注损伤作用提供实验依据和理论基础。1 材料与方法1.1实验材料1.1.1实验仪器 二氧化碳培养箱(RAK 日本) 倒置相差显微镜(OLYMPUS公司) 恒温水浴箱(H2S-H 哈尔滨) 加样器(Labsystem芬兰)显微镜自动暴光系统（（OLYMPUS pm20）超净工作台（SW-CT-EFD苏州）低温台式离心机（AERMLE Z383K 德国） 1.1.2实验药品与试剂人脐静脉内皮细胞株（购置中国科学院上海细胞库）caspase-3,9单克隆鼠抗人抗体（Santa Cruz）辣根过氧化物酶兔抗鼠抗体（Santa Cruz）胰蛋白酶(trypsin)购自（Difco公司.）卡托普利纯品（中美上海施贵宝公司馈赠）高压氮气一瓶（上海比欧西气体工业有限公司）胎牛血清和DMEM合成培养基购自(Sigma Chemical Co.USA)HanK’s缓冲液，D-HanK’s缓冲液PBS缓冲液缺氧液，复氧液1.2 实验方法1.2.1人脐静脉内皮细胞的培养（1）体外培养的人脐静脉内皮细胞形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。（2）2-3d换液一次。换液时将原培养液弃掉1/2-2/3，然后加入新鲜的培养液至原来的量。待细胞长至融合状态后，即可传代。（3）原代培养的细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的D-Hank’s液清洗2次。加入0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞覆盖，室温（20-25℃）下消化1-2min。（4）镜下见细胞稍收缩变圆、细胞间隙增宽后，立即翻转培养瓶，弃酶液。可再用D-Hanks液轻轻洗1次。加入IMDM培养液（pH7.2、100IU/ml青霉素、100g/ml链霉素）和10%胎牛血清。（5）用弯头吸管吸取培养液，轻轻将细胞吹打下来。调整细胞密度至大约1.5×105个/ml。按实验需要接种到新的培养瓶或其他培养皿中。一般按1：2或1：3的比例传代（即1瓶传2-3瓶）。（6）内皮细胞多次传代后，其形态和生物学特性会有所改变，故不宜做长期传代培养。如实验需要可重复从原代建立培养。因此，一般不做冷冻和复苏处理。1.2.2 台盼蓝染色细胞记数 细胞记数对于决定植入的细胞浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度都是极为重要的。 首先取待测的细胞悬液0.1ml加D-Hank’s0.8ml及0.3%台盼蓝0.1ml（死细胞着色），混合后滴入血球记数盘内，按白细胞记数法，于低倍镜下计数4角的4个大格内的活细胞数（透明未着色者），然后按下式记数：细胞浓度（细胞数/ml）=（4个大格内的活细胞数/4）×104×稀释倍数（10）细胞存活率=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%1.2.3缺氧复氧模型的建立取培养至第3代的人脐静脉内皮细胞用缺氧液换液，95%氮气、37℃培养不同时间后，再以复氧液全量换液，并恢复5%CO2气体环境正常培养，建立缺氧复氧模型。1.2.4实验分组与方案 实验随机分三组：（1）对照组（C）：细胞于IMDM培养基中于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱培养 （2）缺氧复氧组（H2/R4）：细胞于缺氧液、100%氮气、37℃条件下培养2小时后，全量换以复氧液，并恢复5%CO2气体环境培养4小时。（4）卡托普利预处理组（CAP）：不同浓度的卡托普利（10-2、10-3、10-4mol/L）预处理24小时后，对EC行缺氧2小时复氧4小时（H2/R4）方案。1.3 Caspase—3，9蛋白表达测定：采用免疫组化染色的方法：收集以上各组细胞，于4℃多聚甲醛固定后过夜，再用0.5%H2O2—甲醇液处理30分钟（封闭细胞内源性过氧化物），再浸入到PBS中洗3×5分钟，滴加5%—10%的正常动物血清，室温，放湿盒中封闭30分钟，滴加一抗，湿盒内4℃过夜，再浸入到PBS中洗3×5分钟，滴加二抗，37℃，30分钟，浸入到PBS中洗3×5分钟，加入避光显色5—10分钟（室温），光镜下控制反应强度（棕色），浸入到PBS中洗3×5分钟，终止反应，经80%，90%，2×100%乙醇溶液脱水，二甲苯透明，每步1分钟，室温放置数分钟，使二甲苯完全蒸发掉，最后滴加1滴封片液。1.4 细胞记数在培养孔边缘统计学分析和中心之间的位置随机选取4个区域进行细胞记数并取平均值，每个区域记数约200个细胞，每组有4个平行孔，计算阳性细胞占细胞总数的百分比.1.5统计学分析各种计量数据均以均数±标准差表示，各组数据间显著性检验采用t检验，多个样本均数比较及两两比较采用ANOVA，统计学分析应用SPSS软件包。P<0.05为差异有显著性。2. 结果2.1卡托普利最适浓度的筛选待细胞生长达80%汇合以后,各组分别加入10-1mol/l，10-2mol/l、10-3 mol/l、10-4 mol/l 、10-5 mol/l 、10-6 mol/l 作用24小时,观察各组细胞的生长状况。收集全部的贴壁和漂浮细胞,用台盼蓝染色后在细胞计数板上进行活细胞计数。活细胞因其细胞膜的完整性而对台盼蓝拒染,死细胞被台盼蓝染成蓝色。活细胞百分数=未着色细胞数/细胞总数(着色细胞数+未着色细胞数)。以细胞生长不受影响而卡托普利浓度达最高时的浓度作为实验最大浓度。2.2 Caspase蛋白表达的检测结果2.2.1对照组的Caspase蛋白表达：对照组的细胞染色均很微弱，说明正常条件下内皮细胞Caspase-3,9的蛋白基本无明显表达，同时也说明Caspase-3,9在正常条件下活性低下。2.2.2卡托普利预处理组的Caspase蛋白表达：与正常对照组细胞微弱的染色相比, 卡托普利预处理组的细胞细胞染色有所增加，与缺氧/复氧组的细胞染色相比则明显减少，各组细胞染色相比P<0.05，差异有统计学意义。这说明缺氧/复氧损伤使血管内皮细胞的Caspase-3,9蛋白表达明显增加，而卡托普利预处理可以明显降低凋亡细胞的Caspase-3,9蛋白表达。2.2.3 Caspase蛋白表达的时间依赖性：卡托普利预处理组的Caspase3、9的表达且随着卡托普利浓度的增加而逐渐降低，这种抑制作用与卡托普利的浓度具有量-效关系。并随着卡托普利浓度的增加而Caspase-3,9的表达降低越明显，三者相比P<0.05，差异有统计学意义.。（表2）（附图2）Table2 Effect of on caspase-3.8.9 expression on HUVEC induced by hypoxia/reoxygenation and preconditioning with captoprilgroup Caspase expression positive cells % Caspase-3 Casepase-9 Control group 4.6±1.9* 5.2±2.8* H2/R4 47.8±2.4* 62.6±2.4* H2/R4 +capotril(10-4) mmol/L 39.2±2.2* 48.6±3.8* H2/R4 +capotril(10-3) mmol/L 30.8±3.6* 39.2±2.8* H2/R4 +capotril(10-2) mmol/L 20.4±2.8* 27.8±3.5* The expression of caspase-3,9 were detected by immunocytochemistry.the Caspase-3、9 were activated in HUVEC during hypoxia/reoxygenation， expression of caspase-3.9 in HUVEC preconditioning with catopril were significantly decreased in contrast with hypoxia/reoxygenation group and significantly decreased followed the catopril concentration increasing.3讨论本实验在离体培养的人脐静脉内皮细胞上，给予不同浓度的卡托普利处理后进行缺氧复氧损伤，从中发现卡托普利预处理组的Caspase3、9表达明显低于缺氧复氧组，且随着卡托普利浓度的增加而逐渐降低，这说明卡托普利具有抑制Caspase蛋白表达的作用，并且这种抑制作用与卡托普利的浓度具有量-效关系。缺血再灌注损伤是一种常见的临床病理生理过程，与心肌梗死，心绞痛等心血管疾病密切相关，故一直是医学界研究的热点问题之一。血管内皮细胞位于血液与组织之间，是各血管组织缺血及再灌注损伤过程中最先受损的部位，大量的在体和离体实验均以证实缺血再灌注可以导致内皮细胞凋亡[13-16]。细胞凋亡不但是缺血再灌注损伤的特征之一，而且细胞凋亡可以加重缺血再灌注损伤，细胞凋亡的多少决定了缺血再灌注损伤的轻重。故通过研究VEC缺氧复氧损伤性凋亡的机制和卡托普利预适应的VEC保护作用来抑制细胞凋亡，对治疗缺血缺氧性疾病有重要的理论和临床意义。细胞凋亡可在四个水平被抑制,即干扰凋亡的刺激因素、在受体/配体水平的功能性拮抗、阻断信号转导、抑制催化性酶,如Caspase、核酸内切酶等。目前，对缺氧再灌注损伤导致细胞凋亡及卡托普利预处理的保护机制尚不十分明确。考虑可能与以下几种因素相关：（1）氧自由基：我们以往的实验证实单纯缺氧和缺氧复氧均可产生大量的超氧阴离子自由基，它可能通过以下几种途径诱导细胞凋[16]。①直接损伤DNA，导致细胞凋亡的发生。②攻击蛋白质，使许多蛋白尤其是具有酶活性的蛋白功能丧失。③影响核基因转录，改变细胞表型特征，诱导凋亡。④直接作用于细胞质膜，引起脂质过氧化反应，从而影响细胞转录系统，最终激活Caspase蛋白及有关调控凋亡的基因，导致细胞凋亡。而经过卡托普利预处理后的内皮细胞，由于卡托普利本身含有巯基（SH），不但具有抑制微粒体脂质过氧化反应及白细胞产生氧自自由基的作用，而且本身是强有力的氧自由基清除剂。Tambd[17]等研究发现卡托普利对缺血再灌注过程中产生氧自由基所至的细胞凋亡具有明显的抑制作用，这与我国学者胡青松等[18]研究发现卡托普利具有抑制羟自由基诱导血管内皮细胞、心肌细胞凋亡的结论相一致。由此可见，卡托普利通过抑制和清除氧自由基的双重作用来阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇P所致T孔开放，此外卡托普利所含有巯基（SH）也可使PT孔处于关闭状态，稳定了线粒体膜电位，阻止Cyt-C及凋亡诱导因子（AIF）从线粒体中释放，有效降低了缺血再灌注损伤过程中Caspase3、9的激活，从而抑制细胞凋亡。（2）各种凋亡相关基因的作用：①Bcl-2家族：Bcl-2家族由两类功能相反的蛋白组成,Bcl-2、Bcl-XL、A1及Mcl-1抑制凋亡,而Bax、Bcl-Xs、Bad和Bak促进凋亡。Bcl-2对细胞凋亡的调控作用主要是通过线粒体依赖性途径实现：Bcl-2蛋白可以在线粒体膜形成阳离子通道，它插入到线粒体膜后通过质子流动和电压依赖性阴离子通道（VDAC）来抑制渗透性转变孔开放，从而防止细胞色素C、凋亡诱导因子（AIF）等促凋亡因子从线粒体释放，阻止了Caspase-3、9的激活，最终抑制细胞凋亡[19-20]。此外Bcl-2还可以直接与胞浆中Caspase-9连接的Apaf-1相结合而存在于线粒体外膜，通过形成线粒体—Bcl-2—Apaf-1—Caspase-9的四聚复合物的形式对Apaf-1的结构进行调控，使Apaf-1失去对Caspase酶系的活化从而抑制细胞凋亡[21]。Matsushita研究小组证明,缺氧处理可使内皮细胞Bcl-2水平明显降低,而Bax水平没有变化,抗凋亡蛋白Bcl-2水平的降低与细胞凋亡相关[8]。对人冠状动脉内皮细胞的研究也发现缺氧再灌注可使Bcl-2水平降低[22]，而Stempien-Otero等发现在脐静脉内皮细胞缺氧性凋亡时,Bax和Bcl-XL水平均未发生变化,Bax/Bcl-XL的比例似乎与细胞凋亡并无相关[23]。从中我们可以推测Bcl-2的水平降低在缺血再灌注损伤导致细胞凋亡的病理过程中起着重要作用。同时Liangxuguo[24]等应用卡托普利和氯沙坦干预由血管紧张素II（AngII）所诱导的血管内皮细胞凋亡的实验中发现，还能降低促凋亡基因表达，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而抑制Caspase-9的激活并阻断了Caspase-3激活所依赖的线粒体途径，减少了Caspase-3的活化而发挥抗细胞凋亡的作用。（3）AngII与其相应的受体AT1结合并共同作用，在增加AT1受体蛋白的表达的同时并明显上调促凋亡基因的表达，进而激活caspase-3导致细胞凋亡[25]；而卡托普利通过抑制血管紧张素转化酶的活性，阻止了AngI转换为AngII，从而不但使AngII所产生的氧自由基和炎性介质减少，而且部分阻断AngII与其相应受体结合所至的细胞凋亡作用。同时，还能降低促凋亡基因表达，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从分子水平发挥抗细胞凋亡的作用[24]。此外卡托普利还能通过减少缓激肽的降解，使增加的缓激肽通过与其β2受体结合,进而激活磷酸酯酶C(PLC),产生的IP3使细胞内Ca2+释放而一氧化氮合酶（NOS）和上调ecNOS，从而增加一氧化氮（NO）的产生[26]，而一氧化氮可以通过半胱氨酸的S亚硝基化来抑制caspase-3的表达，从而减少细胞凋亡[27-28]．Fnjita N[29]通过实验证明，内皮细胞提前经ACEI类药物和缓激肽处理后可以明显减少H/R引起的内皮细胞的凋亡和乳酸脱氢酶的释放，且此作用可以被B2受体阻断剂和一氧化氮合酶抑制剂取消，从而证明，ACEI可以通过上调缓激肽水平从而使一氧化氮合酶活性增加，提高NO的释放，从而达到保护内皮细胞的作用。 通过本实验，我们发现，缺氧再灌注损伤导致的细胞凋亡是可以干预的，从而提示我们可以从减轻细胞凋亡的角度预防缺氧再灌注损伤对细胞的结构和功能的破坏。即通过清除凋亡诱发因素，抑制凋亡的信息传导通路，减少细胞损伤，这将会为保护缺氧再灌注损伤提供新的治疗途径，具有重要的治疗价值。结 论 本实验证明，卡托普利晚期预处理后，内皮细胞在缺氧复氧损伤过程中，Caspase3，9的表达明显降低，且与卡托普利的浓度具有量-效关系。结合进一步的研究我们分析，卡托普利预处理可以通过激活缓激肽B2受体、清除氧自由基、上调bcl-2的表达等多种机制来抑制Caspase3，9在内皮细胞缺血再灌注损伤期间的激活从而发挥内皮细胞的保护作用。同时亦表明卡托普利对血管内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用至少是部分通过降低Caspase-3、9的表达来抑制细胞凋亡而实现的。参考文献[1]. 宋秋景 李建元。缺血预适应的研究现状和前景。 中国药理学与毒理学杂志，2000，14（1）：1-7.[2].Pomerantz B J,Joo K,Shames B D,et al.Andenosine preconditioning reduces both preand postischemias in human myocardium..J Surges. 2000,90[2]:191-196[3] Brenner C,Kroe G.The mitochondrion: decisive for cell death contronl Signaling pathway in apoptosis [M]. Hawood acadamic publishers ,1999:207-216[4] Wolf BB ,Green DR.Suicidal tendencies :apoptotic cell death by caspase family proteinases. J Biol Chem 1999,274-:20049-20052[5]Matsushita H,Morishita R,Nata T et al.Hypoxia-induced endothelial apoptosis through nuclear factor-kappaB(NF-kappaB)-mediated bcl-2 suppression: invivo evidence of the importance of NF-kappaB in endothelial cell regulation [J].Circ Res,2000;86(9):974-981[6] Nicholson DW,Ali A,Thornberry NA ,et al.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian [J]Nature, 1995, 376 (6535): 37-43[7] Roy S,Bayly CI,Gareau Y,et al Maintenance of caspase-3 proenzyme dormancy by an intrinsic “safety catch” regulatory tripeptite.[J] Procnatl Acad Sci USA ,2001,98(11):6132-6137[8].Saikumar P,Dong Z,Mikhailov V et al. Apoptosis:definition ,mechanism and relevance to disease.[J].Am J Med,1999,107(5):489-506[9] Condorelli G ,Roucarati R ,Ross JJ et al.Heart targeted overexpression of caspas-3 in mice increase and depresses cardiac function [J] Proc Natl Acad Sci USA.2001,98(7):9977-9982[10] Cain K,Bratton SB ,Langlas C et al. Apaf-1 oligomeries into biologically active approximately 700-KD and inactive appromately 1.4MD a appoptsome complexes [J] Biol,Chem,2000,275(9):6067-6070[11]. Budihardjo I,Oliver H,Lutter M,et al .Biochemical patchways of caspase activation during apoptosis.Annu Rev .Cell Dev Biol, 1999,15:269-278 [12] 苏定冯 心血管药理学(M) 第一版 北京 科学技术出版社 2001,241-249[13].Holleyman C, Larson D,Hunter K.Stimulation of ischemia reperfusion in endothelialcell culture increase apoptosis J Extra Corpor Technol 2001 Sep, 33(3):175-180[14] Zhang J,Tan Z, Tran ND. Chemical hypoxia-ischemia induces apoptosis in cerebromicrovascular endothelial cell Brain. Res 2000 Sep 22,877(2): 134- 140[15] Hong N,Browning J, Howard T, Winterford C et al. Apoptosis in vascular endothelial cells caused by serum deprivation,oxidative stress and transfo-rming growth factor-beta.Endothelium 1999,7(1):175-180[16] Ing DJ, Zang J, Dzau VJ. Modulation of oytokine-induced cardiac myocyte apoptosis by nitric oxide,Bak and Bcl-x. Circ Res, 1999;84:21-33.[17] Tamba M ，Torreggiani A. Free radical scavenging and copper chelation：a potentially beneficial action of captopril . Free Radic Res，2000;32（3）：199-211[18]罗伟，姜醒华 ,罗伟 羟自由基诱导血管内皮细胞.心肌细胞凋亡及卡托普利的干预作用 江西医学院学报 2001，41（2）136-139[19] Gross A, Mcdonnell JM,Korsmeyer SJ .Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis [J] Genes Dev ,1999,13(15):1899-1908[20] Yang J,Liu XS,Bhala K,et al.Prevention of apoptosis by bcl-2:Cytochrome c from mitochondria blocked[J].Science 2000,275(21):1128-1142[21] Brenner C, Thornberry NA,Lazebink Y. Bcl-2 and Bax regulation the channel activity of the mitochodrial adenine nucleotide translocator .Oncogene 2000,19:329-336[22]Li D,Tomson K,Yang B,et al.Modulation of constitutive nitric oxide synthase, Bcl-2 and Fas expression in cultured human coronary endothelial cells exposed to noxia-reoxygenation and angiotensin :role of AT1 receptor activation [J].Cardiovasc Res,1999;41(1):109-115[23]Stempien-Otero A,Karsan A,Cornejo CJ,et al. Mechanisms of hypoxia induced endothelial cell death:role of p53 in apoptosis [J]. Biol Chem, 1999 ;274:8039-8045[24] 梁绪国，潘其星 氯沙坦和卡托普利合用对凋亡基因调控的影响。国外医学：心血管疾病分册：2003.3.30卷（2）：112-115[25] Goldenberg I,Grossman E ,Masaki H et al Angiotensin II induced apoptosis in rat cardiomyocytes cuture opossible role of AT1 and AT2 receptors J Hypertension 2001 Sep:19(9):1681-96[26]Matsumoto N, Mannabe H ,Ochiai J et al An AT1 receptor antagonist and angiotensin-coverting enzyme inhibitor in hunan aortic endothelial cells throught upregulation of endothelial cell nitric oxide synthase activity . Shock 2003 Jun:19(6):12(3):316-318[27] Li J, Bratton SB, Kunkel G et al.Nitric oxide reversibly inhibit seven members of the caspase family via s-nitrosylation .[J] Biol Chem , 1999, 274:17325-17336[28].Hoffmann J,Haendeler J,Aicher A et,al.Aging enchances the sensitivity of endothelial cells toward apoptotic stimuli important role of nitric oxide Circ Res ,2001,89(8):709-715[29]FnjitaN, Manabe H, Yoshida N et al. Inhibition of angiotension-converting enzyme protects endothelial cell against hypoxia/ reoxygenation injury. Biofactors, 2001; 11(4):257-266本研究先进性1．本实验根据缺血和缺氧有着极其相似的病理改变和发病机制，故设计以培养的人脐静脉内皮细胞的缺氧复氧模型来模拟缺血再灌注损伤模型，而且为了更好的模拟在体时细胞的缺血再灌注状态，在缺氧时我们采用缺氧液培养细胞，除造成缺氧外，同时限制糖，钙及液体量，而在复氧时则用含糖，钙的复氧液，并给予充分的氧，以满足再灌注的条件。2．本实验依细胞凋亡的经典途径为基础，通过检测凋亡过程中的关键酶Caspase3、8、9，来研究缺血再灌注损伤导致血管内皮细胞凋亡的相关机制。3．缺氧和缺氧复氧均可以引起血管内皮细胞的Caspase3、9表达，且表达程度与缺氧复氧损伤时间具有显著的依赖性，这说明Caspase-3， Caspase—9参与了缺氧/复氧诱导HUVEC凋亡这一病理；4．同时Caspase—8的表达在缺氧/复氧诱导细胞凋亡的整个过程中，无明显变化，从中我们可以推测缺氧/复氧诱导血管内皮细胞凋亡主要是通过线粒体途径进行的。这将有助于为寻找适当的治疗靶点提供理论参考。5卡托普利晚期预处理可以降低血管内皮细胞的Caspase3、9表达，此种抑制作用具有剂量依赖性。6卡托普利晚期预处理可以通过激活缓激肽B2受体、清除氧自由基、上调bcl-2的表达等多种机制来抑制Caspase3，9在内皮细胞缺血再灌注损伤期间的激活从而发挥内皮细胞的保护作用。同时亦表明卡托普利对血管内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用至少是部分通过降低Caspase-3、9的表达来抑制细胞凋亡而实现的。中文摘要缺血再灌注损伤的防治一直是心血管领域研究的重点课题。缺血预适应（ischemic preconditionging，IPC）是体内最强大的保护机制，是一种多元性细胞防御现象。IPC的保护作用不仅存在于器官水平，而且存在于细胞水平，不仅可以保护心肌细胞，而且可以保护血管内皮细胞，血管平滑肌细胞。这一现象的发现，为缺血心肌的保护及其机制的探讨开辟了新的领域。且目前的研究已经明确的证实缺氧预处理和缺血预处理具有相似的效应。由于缺血本身是一种损伤，实施损伤性预处理临床还难以接受，目前诱导预处理的研究已从缺血、生物、物理、化学源性扩展到药物性预处理。药物性预处理（pharmacologic preconditioning）是通过药物激发或模拟机体内源性物质呈现的心脏保护作用。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）具有药物预适应作用。ACEI通过诱导或增强预处理早期心脏保护作用已有较多研究，而诱导预处理的延迟保护作用的报道不多；因此，为了研究ACEI晚期预处理在血管内皮细胞缺血再灌注损伤中的保护作用，我们在实验中建立血管内皮细胞缺血再灌注（缺氧复氧）损伤模型，选用卡托普利（ACEI代表药，非前体药），探讨卡托普利和Caspase-3、8、9在人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤中的作用。我们把人脐静脉内皮细胞分为正常对照组、缺氧/复氧组、和卡托普利预处理组；分别进行缺氧2小时复氧1小时、2小时、3小时、4小时；用免疫组化检测Caspase-3、8、9表达。实验结果显示缺氧/复氧组随着复氧时间的延长， Caspase-3、9表达亦随着复氧时间的延长而进行性增加，尤以复氧4小时最为明显；而Caspase—8表达无明显变化。.卡托普利预处理组的Caspase蛋白表达变化与缺氧/复氧组相似，但明显下降，并且细胞的Caspase蛋白表达随着卡托普利的浓度的增加而

摘要:目的 观察曲美他嗪治疗不稳定型心绞痛的临床疗效。 方法 120例不稳定型心绞痛病人随机分为治疗组(60例)与对照组(60例)。对照组给予硝酸酯类药物、阿司匹林、他汀类降脂药、β受体阻滞剂或钙离子拮抗剂等常规治疗。治疗组在上述治疗的基础上加用曲美他嗪，每次20 mg,每日3次口服,连用14 d。结果 心电图疗效,治疗组总有效率为95.0%,对照组为73.3%;心绞痛疗效,治疗组总有效率为93.3%,对照组为66.7%。两组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论 曲美他嗪可有效控制不稳定型心绞痛发作,安全方便。关键词:不稳定心绞痛；曲美他嗪；1资料和方法1.1病例选择和分组，以中华医学会心血管病学会制定的《不稳定心绞痛诊断和治疗建议》为标准[2]，选取我院循环内科2008年2月—2009年12月的住院患者120例，其中排除严重肝肾功能不全、有出血倾向或凝血功能异常、近期有手术或其他出血性疾病以及严重高血压未有效控制者。将入选病例随机分成2组：对照组60例，年龄45-75岁，男性32例，女性28例，其中初发心绞痛20例，恶化劳力型心绞痛 28例，静息性心绞痛 7例，梗死后心绞痛5例；治疗组60例，男性31例，女性29例，其中初发心绞痛19例，恶化劳力型心绞痛 27例，静息性心绞痛 7例，梗死后心绞痛7例.治疗组和对照组在年龄、性别、心绞痛类型及其危险分层差异均无统计学意义(P>0.05)。1.2方法：对照组常规应用阿司匹林抗凝、他汀类调脂、硝酸脂类药物扩冠，β受体阻滞剂或钙离子拮抗剂。治疗组在常规治疗基础上加用曲美他嗪(万爽力,法国施维雅药厂)每次20 mg次20 mg,日3次口服，连续用14天。1.3观察指标：住院治疗期间观察记录心绞痛的发作频率，硝酸甘油的日使用量及常规检测血压，心率及心电图。治疗前后均行血尿常规及肝肾功能检查。1.4疗效判定标准 以1993年卫生部制定的《心血管系统药物临床研究指导原则》为评判标准：（1）显效：同等劳累程度不引起心绞痛或心绞痛发作次数较少80%以上，硝酸甘油用量减少80%以上，静息时心电图恢复正常,；（2）有效：心绞痛发作次数及硝酸甘油消耗量均减少50%~80%，ST段下移回升≥0.05mv,但未达到正常水平，主要导联的T波倒置变浅或由低平转为直立；（3）无效：心绞痛发作频率及硝酸甘油用量均减少不到50%，治疗前后的静息或次极量运动心电图ST-T无变化。1.5资料统计学处理 选用统计学软件包SPSS13.0进行数据分析，临床疗效和心电图疗效均采用χ2检验，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 两组心绞痛临床疗效对比（表1）表1 两组心绞痛疗效比较例(%)组别 n 显效 有效 无效 总有效对照组 60 25(41.7) 16(26.7) 19(31.6) 42(70.0)治疗组 60 39(65.0) 17(28.3) 4(6.7) 56(93.3) 注:两组总有效率比较,P<0.05。2.2 两组心电图疗效比较(见表2)表2 两组心电图疗效比较例(%)组别 n 显效 有效 无效 总有效对照组60 28(46.7) 15(25.0) 17(28.3) 43(71.6)治疗组60 38(63.3) 18(30.0) 4(6.7) 57(95.0)注:两组总有效率比较,P<0.05。2.3 药物不良反应 治疗组在治疗期间未发现与曲美他嗪相关的副作用。3 讨论 不稳定心绞痛是由于心肌需氧与供氧之间暂时失去了平衡而发生的心肌代谢障碍，有氧氧化受到抑制，一方面乳酸大量堆积导致酸中毒而引起使心肌收缩功能异常;另一方面三磷酸腺苷ATP产生不足，钠钾泵受到抑制，引起线粒体内钙超载，导致线粒体肿胀，造成心肌细胞不可逆的损伤。因此针对心肌缺血时的代谢变化进行治疗，采取改善心肌能量代谢已成为现代治疗冠心病的重要手段[4-5].。曲美他嗪是一种哌嗪类衍生物，它可以改变心肌细胞的有氧代谢途径，增加ATP生成，减轻细胞内钙超载，保护线粒体的结构和功能，同时通过提高氧自由基清除酶的活力减少氧自由的产生并抑制氧自由基对细胞膜的氧化反应，减轻其对心肌细胞的毒性，从细胞水平发挥其抗心肌缺血的药理作用。此外，由于曲美他嗪是通过代谢效应治疗心肌缺血，从而具有不影响血液动力学变化，不增加心肌耗氧量，不降低心肌收缩力的其他传统治疗无法比拟的优点。本研究表明传统治疗方法联合曲美他嗪治疗冠心病不稳定型心绞痛的临床疗效、心电图改善情况均优于单纯传统治疗, 且不影响心率、血压变化,无严重不良反应出现,无一例出现急性心肌梗死及猝死,因此曲美他嗪治疗冠心病不稳定型心绞痛安全、有效、值得临床推广。[参 考 文 献][1] 滕尧文.曲美他嗪治疗不稳定型心绞痛的疗效评价[J].中国心血管研究杂志,2005,3(3):212-213.[2] 中国医学会心血管分会.不稳定性心绞痛诊断和治疗建议[J].中国循环杂志,2001,16(3):227-229.[3] 中华医学会心血管病学分会,中华心血管病杂志编辑委员会.慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南[J].中华心血管病杂志, 2007,35(3): 195-205. [4] Palerini T,Sangiorgi D,M arzocchi A,et al. Impact of acute coronary syndromes on two year clinical outcomes in patients with unprotected left main coronary artery stenosis treated with drug-eluting stents[J ] Am J Cardiol 2010 ,105(2):174-178[5] Thadani U .Seletion of optimal theraphy for chronic stable angina [J] .Curr Treat Options Cardiovasc Med 2006.8(1):23-35

摘要]目的 研究卡托普利干预细胞凋亡的作用及相关机制。方法 本文采取文献回顾的方法对卡托普利干预细胞凋亡的作用及相关机制作一综述。结果 卡托普利具有抑制和诱导细胞凋亡的双重作用。结论 卡托普利能够通过多种机制调节细胞凋亡。[关键词] 卡托普利 干预 细胞凋亡 Advances in Research of Captopril Intervening Cell ApoptosisSuTeng ZhengYang collation[Obstract] objective to investigate the function of captopril intervening apoptsis and its releavant mechanism . Method the published papers to explore the function and machanism of captopril intervening apoptosis were reviewed. Result Captopril not only can hold back but also induce cell apoptosis .Conclusion captopril regulate cell apoptosis by several mechanisms[key words] Captopril regulate apoptosis卡托普利是第一个口服有效的血管紧张素转化酶抑制剂，自从1981年由美国FDA批准用于治疗高血压以来，卡托普利在治疗充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重构和糖尿病肾病中取得了良好的疗效。它在血管紧张素转化酶抑制剂中应用范围最广[1]。随着相关基础科学的迅猛发展和对卡托普利药理作用研究的深入，近来人们在大量的动物和临床实验中发现卡托普利具有抑制和诱导细胞凋亡的双重作用[2-7]，本文采用文献回顾的方法对卡托普利干预细胞凋亡的作用及相关机制作一综述。1卡托普利的药理作用卡托普利是含有巯基（SH）的血管紧张素转化酶抑制剂,它不但具有其他的血管紧张素转化酶抑制剂药理作用：（1）阻止血管紧张素II(AngII)的生成和作用；（2）保存缓激肽的活性；（3）保护血管内皮细胞与抗动脉粥洋硬化作用；（4）抗心肌缺血和心肌保护作用；（5）增加糖尿病病人对胰岛素的敏感性；（6）阻止心血管病理性重构，而且能通过所含有的巯基清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，起到稳定线粒体膜的作用[8]，此外卡托普利还具有抑制单核巨噬细胞产生肿瘤坏死因子，白细胞介素等细胞因子的免疫学效应[9]。2: 细胞凋亡2.1 细胞凋亡的概念及其基因调控细胞凋亡是指在一定的生理和病理条件下,遵循自身的程序通过启动内部机制,主要是内源性DNA内切酶的激活,从而结束其生命的过程.目前的研究表明，细胞凋亡是基因调控的一种细胞死亡的特殊形式，其调控基因可分为促凋亡基因，包括野生型P53.c-myc，c-fas，c-jun，bcl-bax，ras，IC等基因；抑凋亡基因主要包括Bcl-2和突变型P53。自1972年Kerr[10]等首次提出细胞凋亡概念以来, 细胞凋亡一直是近年来医学界的研究热点.2.2细胞凋亡的通路细胞凋亡的通路主要有两条,一条是死亡受体途径[11]：死亡受体属于肿瘤因子受体(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞内部分含有一个死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配体是一个同源三聚体，每个三聚体分子结合3个Fas分子。一旦与三聚体的配体相结合，Fas通过胞内段的DD和FADD羧基端的DD之间的相互作用，募集胞质中的衔接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas区域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡诱导信号复合体（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增强，而自我剪切活化 。活化的Caspase-8释放到细胞质中即激活Caspase—3，引起细胞凋亡；另一条是线粒体途径[12]：线粒体通路[2]：各种促凋亡信号如DNA损伤、生长因子去除等诱导线粒体释放细胞色素C，在ATP/dATP存在的情况下，细胞色素C结合到Apaf-1的WD40重复区域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-细胞上色素C多聚复合体。此复合体通过Apaf-1的氨基端的CARD与Caspase-9原域的CARD之间的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞质的Caspase—9。Caspase—9酶原之间因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作为起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3促使细胞凋亡。3卡托普利抑制细胞凋亡3.1卡托普利抑制AngII诱导的细胞凋亡AngII对细胞凋亡有重要的影响，但作用机制较复杂，不同的细胞表现出不同的作用：既可以引起细胞凋亡，也可以引起细胞增生[13]，这主要与AngII和其相应的受体AT1，AT2结合所发挥的生物学效应有关。Goldenberg I[14]等实验发现AngII与其相应的受体AT1，AT2结合并共同作用，在增加AT1，AT2受体蛋白的表达的同时并明显上调促凋亡基因的表达，进而激活caspase-3导致细胞凋亡。但亦有研究表明：AT1受体和AT2受体与AngII结合而发挥的作用相反：即AT1受体与AngII结合具有促进细胞增生的作用；AT2受体与AngII结合具有诱导的细胞凋亡作用[15]。这与Liangxuguo[16]等应用卡托普利和氯沙坦干预由AngII所诱导的血管内皮细胞凋亡的实验内结果相一致：氯沙坦作为AT1受体拮抗剂，虽然阻断了AngII与AT1的结合,但对AngII所诱导的细胞调亡无影响，从而说明AT1受体在AngII所诱导的细胞凋亡过程中无明显作用；而使用卡托普利能部分抑制AngII诱导的血管内皮细胞凋亡，其可能机制为卡托普利通过抑制血管紧张素转化酶的活性，阻止了AngI转换为AngII，从而不但使AngII所产生的氧自由基和炎性介质减少，而且部分阻断AngII与其相应受体结合所至的细胞凋亡作用。同时，还能降低促凋亡基因表达，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从分子水平发挥抗细胞凋亡的作用[17]。此外还与卡托普利能减少缓激肽的降解，增加NO的分泌有关[18]。3.2卡托普利抑制氧自由基诱导的细胞凋亡氧自由基可以通过直接损伤DNA，攻击含有酶活性的蛋白质，影响核基因转录，引发脂质过氧化反应等多种途径诱导细胞凋亡。这已经在大量的实验中得以证实。同时，亦有实验证明用抗氧化剂或氧自由基清除剂干预氧自由基诱导的细胞凋亡，能通过阻止P53的激活、下调Bax蛋白的基因表达及降低Caspase-3的活性而抑制细胞凋亡[19]。而卡托普利本身含有巯基（SH），不但具有抑制微粒体脂质过氧化反应及白细胞产生氧自自由基的作用，而且本身是强有力的氧自由基清除剂 [20]。Tambd[21]等研究发现卡托普利对缺血再灌注过程中产生氧自由基所至的细胞凋亡具有明显的抑制作用，这与我国学者胡青松[22-23]研究发现卡托普利具有抑制羟自由基诱导血管内皮细胞、心肌细胞凋亡的结论相一致。由此可见，卡托普利通过抑制和清除氧自由基的双重作用来阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇所激发PT孔开放，同时，卡托普利所含有巯基（SH）可使PT孔处于关闭状态[24]，稳定了线粒体膜电位，阻止Cyt-C及凋亡诱导因子（AIF）从线粒体中释放，从而阻断细胞凋亡的线粒体途径而发挥抑制细胞凋亡的作用。同时卡托普利对线粒体复合体II-III质子泵泵出速度和电子传递速度升高有调节作用，使质子偶联更紧密，从而保护线粒体的呼吸功能，改善细胞的能量代谢[25]，有效阻止氧自由基所造成的细胞内钙超载。3.3卡托普利阻止缓激肽降解而抑制细胞凋亡实验证明卡托普利能通过减少缓激肽的降解，使增加的缓激肽通过与其β2受体结合,进而激活磷酸酯酶C(PLC),产生的IP3使细胞内Ca2+释放而导致一氧化氮合酶（NOS）增加、上调结构型一氧化氮的基因表达（ecNOS），从而增加一氧化氮（NO）的产生[26]。NO对细胞具有双重作用，即在通过产生氧自由基介导细胞凋亡的同时，可以通过抑制Caspase酶活性而产生抗细胞凋亡作用，作用结果与细胞类型和NO的量有关[27]。Dimmelers[18]等实验证明NO能通过抑制Caspase酶活性而阻断AngII所致的细胞凋亡作用，但Fukuok [28]等实验发现NO能通过上调Fas及Bax的表达而介导细胞凋亡。因此我们可以认为卡托普利可能一方面通过适当增加NO水平，另一方面通过其所含有巯基而清除NO产生的过量的氧自由基而共同发挥抗细胞凋亡的作用。此外，通过缓激肽-NO 途径可以激活蛋白激酶C，降低细胞代谢水平，降低ATP及氧的需求，改善细胞的能量代谢，阻止细胞凋亡[29]。3.4 其他最近研究发现卡托普利能阻断由Fas受体介导细胞凋亡：UhalBD[4]等研究发现卡托普利通过降低肺泡上皮细胞表面的Fas和其配体（Fasl）的表达而抑制凋亡。此外Odakac Mizuochi T[30]等证实卡托普利通过干扰外周T细胞表面的Fas和Fasl之间的相互作用，并能降低凋亡过程中产生的Caspase-3类似物的活性而抑制凋亡。这为我们研究卡托普利在自身免疫病的应用开辟了新的道路。4卡托普利诱导细胞凋亡已有实验证明卡托普利具有促进细胞凋亡的作用，Buemi M[5]等发现在实验中卡托普利0.23mg可以引起血管平滑肌细胞凋亡数目增加，同样Anne Mette[6]等动物模型中发现卡托普利通过诱导血管平滑肌细胞凋亡而抑制受损伤后血管内膜的增生狭窄。这其中的具体机制还不清楚，可能是卡托普利能降低心肌梗死后血管内膜AngII的AT1受体的mRNA的表达[31]，从而引起AngII与AT1结和所致的细胞增生及抗凋亡作用减弱，而与AT2 受体结合所致的细胞凋亡作用增强的结果[32-33]。此外Ohwada T[34]等研究发现对大鼠血管拉伤后给予血管紧张素转化酶抑制剂治疗，不但可以明显增加新生内膜eNOS的表达,同时也可上调诱生型一氧化氮（iNOS）的表达，导致NO产生过多，而过多NO能通过上调Fas及Bax的表达，下调Bcl-2的表达诱导平滑肌细胞凋亡[28]。近来Glzzerman I[7]等在临床上应用ACEI治疗肾移植术后病人发生的红细胞增多症取得了成功，并阐明其作用机制为ACEI能诱导肾移植术后病人Fas及其接头蛋白FADD的mRNA表达增加,上调其蛋白表达，但对BCL-2.Bcl-xl.Bax,caspase-8.caspase-3的表达无影响，从而通过激活死亡受体途径诱导祖红细胞凋亡。由此可见，卡托普利对细胞凋亡所具有促进的作用无疑有利于治疗冠状动脉手术后的内膜增生和再狭窄，同时也为其治疗IgA肾病及糖尿病肾病提供了新的理论基础。问题和展望综上所述，卡托普利具有抑制和诱导细胞凋亡的双重作用。但目前的问题是卡托普利为什么会产生两种截然不同的药理作用。我们推测这主要取决于细胞类型，卡托普利的剂量以及机体所处病理状态等因素，但具体的机制有待进一步研究。总之，卡托普利干预细胞凋亡的作用已经得到了共识：卡托普利通过阻断AngII与其受体之间的作用，减少氧自由基的产生，调控NO的合成，干扰Fas和Fasl之间的相互作用来激活或阻断细胞凋亡程序，从而抑制或促进细胞凋亡。我们有理由相信：通过对卡托普利抗细胞凋亡作用深入研究，无疑为探讨充血性心力衰竭，缺血再灌注损伤以及冠状动脉粥样硬化及手术后的再狭窄等带来突破，并可推动心血管疾病治疗的发展。参考文献1 苏定冯 心血管药理学(M) 第一版 北京 科学技术出版社 2001,241-2492 LihlSuzukj J, Bayna E，Zhang FM et，al。Lipopolysaccharide induces apoptosis in adult rat ventricular myocytes via cardiac AT（1） receptors Am J，Physiol heart circ physiol 2002 ; Aug：283（2）：H461-73 Deaso ，Dumont C，Mollereau B et . al. Thiol-mediated inhibition of Fas and CD2 apoptotic singaling in activated human peripheral T cells Int，Immunol，1997.9：117-254 Uhal BD ，Gidea C，Bargout R et al.Captopril inhibits apoptosis in human lung epithelial cells a potential antifibrotic mechanism Am，J，Physoil. 1998：275：1013-75 Buemi M ， Allegra A，Marino D et al .Does captopril have a direct proapoptotic effect Nephron 1999,JAN;81(1):99-1016 Anne Mette ，Holm Claus Bogelund ，Peter Riis Hansen et al. ACE-inhibition promotes apoptosis after balloon injury of rat carotid arteries Cardiovascular Research , 2000;(45):777-7827 Glzzerman I,Patel H, Glicklich D et al .Angiotensin-coverting enzyme inhibition induces death receptor apoptosis pathways in erythoid precursors following renal transplantation. Am J Nephrol.2003 jul-Aug :23(4):195-2018 Constantinescu CS ,Goodman DB, Pauls H et al.Captopril and lisinopril suppress production of interleukin-12 by human peripheral blood mononu clear cells Immol letters 1998,62:25-319 Jay D Captopril and glutathione inhibit the superoxide dismutase activity of Hg(II) Arch Inst Cardiol Mex.1998,68:457-6110 Kerr JF, Wyllie AH ，Currie AR Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics Br J cancer 1972，26（4）：239-5711 Ashkenazi A ,Dixit VM，Death receptors：singnaling and modulation （J） Science 1998，281（28）：1035-4112 Cain K ,Bratton SB ,Langlais C et al Apaf-1 oligomerizes into biologically active approximately 700-KDa and inactive approximately 1.4-MDa appoptsome complexes （J） Biol，chem ：2000：275（9）：6067-607013 Diep QN, EI Mabrouk, Yue P et al Effect of AT(1) receptor blockade on cardiac apoptosis in angiotensinII induced hypertension.Am J Physiol Heart Circ Physiol ,2002-May;282(5)H1:635-4114Goldenberg I,Grossman E ,Masaki H et al Angiotensin II induced apoptosis in rat cardiomyocytes cuture opossible role of AT1 and AT2 receptors J Hypertension 2001 Sep:19(9):1681-915 Mccarthy NJ ,Benett MR, The regulation of vascular smooth muscle cell apoptosis Cardiovase Res,2000,45(3): 747-75516 Liang xu guo, Hou gui hua,,Pan qi xing Effect of AngiotensinII captopril and losartan on apoptosis in vascular endothelial cells Juournal of ShanDong university ，2002：（40），44：300-30417 梁绪国，潘其星 氯沙坦和卡托普利合用对凋亡基因调控的影响。国外医学：心血管疾病分册：2003;3:30卷（2）：112-11518 Dimmerler S ,Rippmannn V，Weiland U et al .AngiotensinII induces apoptosis of human endothelial cells protective effect of nitric oxide circ Res 1997，81：970--97619 Oskarsson J, Coppy ,Weiss R et al Antioxidants attenuate myocyte apoptosis in the remote non-infarcted myocardium following large myocardial infarction (J) Cardiovasc Res.2000.45(3):679-68720 Sogaard P,Klausen IC, Rungby J et al Lipoprotein(a) and oxygen free radicals in survivors of acute myocardial infarction effects of captopril Cardiology 1996 .87(1):18-2221 Tamba M ，Torreggiani A. Free radical scavenging and copper chelation：a potentially beneficial action of captopril . Free Radic Res，2000，32（3）：199-21122 胡青松，罗伟 ,程晓署外源羟自由基诱导血管内皮细胞凋亡及卡托普利的干预作用.江西医药。2002 ，37：（2）95-9823罗伟，姜醒华,罗伟 羟自由基诱导血管内皮细胞.心肌细胞凋亡及卡托普利的干预作用江西医学院学报 2001，41（2）136-13924 Vieira HL,Dorge H The mitochondrion:desive for cell death control ? signaling pathway in aooptosis Cell Death Differ 2000：7（12）：114625 苏晓华，姜晓林 卡托普利对缺血再灌注心肌线粒体电子-质子偶联和氧化磷酸化的影响。中国病理生理 1996，12（3）：316-31826 Matsumoto N, Mannabe H ,Ochiai J et al An AT1 receptor antagonist and angiotensin-coverting enzyme inhibitor in hunan aortic endothelial cells throught upregulation of endothelial cell nitric oxide synthase activity . Shock 2003 Jun:19(6):12(3):316-31827 Stefanelli C , Pignati C ,Tantini B et al. Nitric Oxide can function as a killer molecule or antiapoptotic efector in cardiomyocytes Biochim Biophys Acta 1999,1450:406--1328 Fukuo K, Hata S ,Sohara T et al .Nitric oxide induces upregulation of fas and apoptosis in vascular smooth muscle Hypertension, 1996; 27:823-2629 Yoshida H,Zhang JJ ,Chao L et al Kallikrein gene delivery attenuates myocardial infrarction and apoptosis after myocardial ischemia and reperfusion Hypertension 2000;35:25-31 30 Odaka C ,Mizuochi T Angiotensin-converting enzyme inhibitor captopril prevents activation-induced apoptosis by interfering with T Cell activaton signals Clin Exp .2000.Sep;121(3):515-2231 Zhang Gx ,Pu Sy ,Yang Yz et al. Effect of losartan and captopril on expression of cardioc angiotensinII AT1 receptor mRNA in rats following myocardial in farction Zhongguo Yao Li Xue Bao.1997 sep;18(5):431-41232 Yamada T ,Akishita M,Pollman MJ et al .AngiotensinII type 2 receptor mediates vascular smooth muscle cell apoptosis and angiotensinII type 1 receptor action: an in vitro gene transfer study life .Sci 1998:63 :289-29533.Tea BS,Der PB, Sarkissian S et al Proapoptotic and growth-inhibitory role of angiotensinII type 2 receptor in vasucar smooth muscles cell of spontaneously hypertension rats in vivo Hypertension 2000,May,35(5):1069-73 34 Ohwada T, Ishibshi T ,Yaoita H et al .Different contribution of apoptosis to the antiproliferative effects of L-arginine.enalapril and losartan on neointimal growth inhibition after balloon arterial injury Circ J2002 Oct :66(10):965-71

当代医学研究表明：心室重构是慢性充血性心力衰竭的基本机制，而肾素—血管紧张素—醛固酮系统和交感神经的过度激活贯穿于心室重构和心衰发生、发展的整个过程。故拮抗肾素—血管紧张素—醛固酮和交感神经系统的过度激活，逆转左心室重构成为现代治疗心力衰竭的主要措施。我科选取30例慢性心衰患者作为对照组，常规给予强心、利尿、扩血管治疗，治疗组30加用血管紧张素转换酶抑制剂咪达普利和非选择性β受体阻滞剂卡维地洛，观察对比两组患者左室收缩及舒张功能的变化现报道如下:1 资料和方法1.1 病例选择 将2008年8月至2010年5月在我循环内科住院的慢性充血性心力衰竭的患者60例（排除哮喘和慢性阻塞性肺疾病；收缩压＜90 mmHg,，心率＜50次/min；P-R间期>0.24秒；Ⅱ度或Ⅲ度房室传导阻滞；心功能Ⅳ级的患者）随机分成治疗组和对照组各30例，两组的年龄、性别、心力衰竭的病程、心功能分级及其基础疾病等均无统计学意义，故具有可比性。1.2 方法 对照组常规给予强心、利尿及扩血管治疗，同时积极治疗心力衰竭的基础疾病和去除其诱发因素，治疗组在上述常规治疗的基础上加用咪达普利和卡维地洛，起始剂量分别为2.5mg和3.25mg，如无不良反应则根据患者耐受及心衰控制情况逐步增加剂量，7—14天一次，每次倍增，最大耐受剂量以收缩压≥90mmHg，心率≥50次/分等生命体征平稳，临床症状缓解为判定标准，如果患者不耐受或心衰加重则适当减少药物剂量，待临床症状稳定后在逐步增加剂量直至两者的靶剂量或最大耐受剂量（分别为20mg和25mg）。出院后按确定的靶剂量继续服药共观察六个月。1.3 观察指标 治疗前、后使用心脏多普勒超声检查患者的左室舒张末径，左室收缩末径，左室射血分数的变化。1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行，用药前后组间对比采用等方差t检验，组内对比采用配对t检验。 以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 对照组的左室舒张末径及左室收缩末径较治疗前比无显著性差异（P>0.05），治疗组的左室舒张末径及左室收缩末径较治疗前比明显降低(p<0.05)，且两组间差异有统计学意义；心脏射血分数两组均有提高，但治疗组的射血分数提高程度优于对照组，两组间差异有统计学意义(p<0.05)。见表表 药物治疗前后两组左室舒张末径，左室收缩末径，左室射血分数的变化（x±s）组别 例数左室舒张末径（mm） 左室收缩末径（mm） 左室射血分数(%)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后对照组 30 60.74±3.93 60.29±3.88 52.52±1.98 53.97±2.68 34±7 39±6治疗组 30 61.64±3.82 58.68±4.12 53.64±2.09 47.64±3.18 35±7 42±6P值 P>0.05 P<0.05 P>0.05 P<0.05 P>0.05 P<0.05 3讨论在2005年ACC/AHA成人慢性心力衰竭的诊断与治疗指南中明确了血管紧张素转换酶抑制剂和β受体阻滞剂在心衰患者中的治疗作用，ACEI主要通过抑制RASS系统，阻断血管紧张素(AngⅠ)转化为AngⅡ，从而降低循环和组织的AngⅡ水平，起到扩张血管和抗增生作用;通过抑制缓激肽的降解，提高缓激肽水平，使其通过缓激肽-前列腺素-一氧化氮通路而发挥有益作用[1]。咪达普利是长效ACEI制剂，口服后转换为活性产物咪达普利拉，其广泛分布于血浆和组织的内皮细胞中，对RASS系统具有高度选择性，从而减轻心脏负荷，改善心脏舒张功能，逆转并降低心脏不可溶胶原/可溶胶原比值，保护血管内皮，提供NO，降低心肌僵硬度，改善心脏舒张功能。此外ACEI所致的咳嗽发生率为5%~20%,而咪达普利的咳嗽发生率约为0.9%,原因是咪达普利对RAAS有高度的选择性,它抑制AngⅡ生成的能力强于抑制缓激肽水解的能力,可以使缓激肽适当积蓄,减少咳嗽发生。卡维地洛是一种无内源拟交感活性的非选择性β受体阻滞剂，它可以一方面通过阻断α1受体扩张外周阻力血管，使心衰患者的左房压和肺毛细血管楔压下降，降低心脏后负荷；另一方面通过阻断β受体减少了心衰时肾素—血管紧张素—醛固酮系统和交感神经过度激活而产生的神经递质，从而减轻其对心肌的毒性作用和并去除交感神经支配不均匀所造成室壁运动不协调，阻止心室重构[2]，使心率和心肌耗氧量降低，间接增加心肌的能量储备；此外还有抗氧自由基、抗氧化损伤，抗细胞增殖等其他β受体没有的作用[3]，从而起到保护心肌改善心功能的作用。本治疗组患者发生不良反应均较轻微,其中心动过缓、心衰加重、低血压的发生可能与β受体阻滞剂的负性频率与负性肌力有关,经调整治疗均好转,可继续维持用药,所有患者在随访期间未发现糖、脂代谢异常,无肾功能损害发生。说明在在充血性心力衰竭患者的治疗中，除常规的强心、利尿、扩血管治疗外，应尽早加用卡维地洛及咪达普利治疗，不但有较好的安全性、耐受性，更加有利于充血性心力衰竭患者的左室功能的改善和预后。【参考文献】[1]中华医学会心血管病学分会，中华心血管病杂志编辑委员会. 慢性心力衰竭诊断治疗指南[J]. 中华心血管病杂志，2007，35(12)：1076-1095.[2] 陈新谦,金有豫,汤光.新编药物学[M]. 16版.北京:人民卫生出版社,2007:342[3] 东杰,王绍欣,王宏运.卡维地洛治疗慢性心衰竭疗效观察[J].临床荟萃,2007,22(15):1115～1116.

我是人体里的一个细胞。在我们细胞家庭里，我算是淘气的。我不喜欢沿着上帝给我安排好的路走，我喜欢东游西逛。人类给我这样的细胞起了个恐怖的名字，叫癌细胞。不少人被我们夺去了生命，那是因为他们对我们一无所知，我们这些人惋惜。我们这些淘气的细胞在一起聊天时常说：如果我们的世界里也有诺贝尔奖，我们一定授予那个将我们定名为“癌”的医生，是他给我们起的这个杀气腾腾的名字帮我们打败了人类。 其实我们真正的名字是 - 淘气细胞。假如当初那位医生这样给我们定名，保准我们败在人类手下。我把我们家族的底儿交给人类，是违反纪律的。可我不忍目睹人类中的一些孩子因我们在他们体内的存在而离开人世间。经过一段时间的犹豫，我终于决定豁出去把我们家族的秘密告诉人类： 人体里有许许多多细胞，我们所从事的工作就是在一条宽阔的道路上进行接力赛跑。从人诞生开始，我们细胞家族就一代接一代地往前跑。是我们的这种运动支撑着生命的存在。当我们跑到终点时，这个人的生命就结束了。在每个人体内的这个庞大的细胞家族中，并不是所有细胞都是那么循规蹈矩的。有的细胞天生淘气 - 比如我。我不愿意沿着跑道跑，我觉得这样太枯燥，我想去别处看看。于是，当我发现大道旁边有小路时，我就悄悄离开家族，溜到小路上去了。这种从大道上溜到小路上去的现象，人类管它叫正常细胞的癌变。这是不是有点儿言过其实或者叫做危言耸听？ 现在我再告诉你，我们细胞家族和人体里的所有部位一样都听大脑指挥。大脑和我们之间的通讯系统比人类现在使用的最先进的通讯设备还要先进 100倍。什么卫星通讯啦，什么移动式电话啦，什么国际直播长途啦，在我们看来都是原始社会的陈糠烂谷子。不信你现在做个试验，你只要稍微一想起你的右手，你的右手马上就动起来了，不吗？这说明你身体的任何一个部位都服从于你的大脑的指挥。连那么大的胳膊都毫无条件地听命于你的大脑，何况我们这些微不足道的小小细胞了。大脑给我们下的指令比皇帝给臣民下的圣旨更加神圣不可违背。 对于我们这些淘气的“癌”细胞，其实当事人的大脑只要发出一道威严的圣旨 - 立即返回跑道，我们都会诚惶诚恐连滚带爬地归队的。遗憾的是，每当我们走上小路时，就会有医生告诉当事人说他得了癌症。当事人的大脑就乱了方寸，恐怖和绝望占据了大脑的所有空间，大脑不但不命令我们归队，反而发出“我不行了”的指令，这导致更多细胞跟着我们离队。这时医生又告诉当事人说，你的癌细胞扩散了！于是当事人的大脑更加惊慌失措，所有通讯系统失灵，所有细胞群龙无首，成群结队地离开大道。坚持在人体的主跑道上运动的细胞越来越少，大伙都去身体的各处旅游，这个人的生命也就该结束了。 说到这里，你该恍然大悟了吧？你的大脑是你全身所有细胞和一切的皇帝，而你又是你的大脑的皇帝。你全身的一切都无条件地听你指挥。如果你身体里有几个细胞离队，你千万别忙，也千万别听医生瞎说管我们叫“癌”，你就管我们叫淘气细胞好了。你通过你的大脑向我们下一道威严的圣旨 - 立即归队！我们一准会乖乖归队的。不信你试试。 你也许还半信半疑，那我给你举个例子，听说人类中有个叫美国的地方医疗科技最发达。可你知道吗，美国的癌症误诊率？百分之四十。也就是说，一百个被医生确诊？患癌症的病人中有四十个并未患癌。可这四十个被误诊？“癌”的人却会因“癌”而死去。为什么呢？当他们知道自己得了“癌”后，大脑立即放弃了对全身的指挥权，人体顿时陷入无??政府状态，各机构纷纷独立，军阀混战，生灵涂炭，人能不死吗？ 假如二十位医学权威对一个健康人说：你患了癌症！假如这位健康人的所有亲朋好友都由此对他无微不至地关怀，由此开导他想开点，由此劝他多吃好的，多玩好的，多用好的，这位健康人十有***活不过两年。你不信 我向你透露一个绝密的统计数位：自有人类以来，还没有一个人是被癌细胞夺走生命的 - 上帝没赋予我们这么大的本事。那些被诊断后因癌症死亡的人，都是由于自己放弃了大脑对淘气细胞的指挥权而丧生的。哟，我接到信号了！瞧，这是我生活的人体里的大脑发给我的，它命令我立即无条件归队！我得回到主跑道上继续我们家族的接力赛去了。你看，我的主人牢牢握住指挥权不放，我们这些淘气细胞没辙，生活在人家体内，不听人家的听谁的。 我可是细胞家族中第一个泄露天机的。你的生命的生存权其实就掌握在你自己手里。再说两句：一，千万别放弃你的大脑对全身的指挥权;二，别再管我们叫癌细胞，我们的正确名称是淘气细胞。把我的这段话当作童话看的人，我会为他感到遗憾;将我这段话当作纪实文学看的人，必定长命百岁。原文地址：澳大利亚深层沟通的博客－一个泄露天机的淘气细胞的话

患乳腺疾病时，应选择乳腺专科。为什么？好处何在？一．它拥有一批富有乳腺疾病诊治经验的，技术一流的专业人才队伍，具有较高的诊疗水平： 乳腺专科的医生和护士大都经过严格的医学综合基础训练后再进行专科培训的，具有良好的专业素养。由于专科化的发展，使他们无论是在对乳腺以及乳腺疾病的整体认识上，还是在对乳腺疾病的诊治理念上，都能与时俱进的。 由于专科化的发展，使他们利用大量的时间专研与乳腺疾病诊疗相关的各种先进诊疗手段，使他们掌握了更新更全面的诊疗技术。 由于专科化的发展，使他们有更多机会接触乳腺患者，反复尝试最新的诊疗方法，乳腺癌的诊治与国际和国内的诊疗标准接轨，达到乳腺癌诊疗的规范化。 由于专科化的发展，使他们治疗上达到多样化。例如就乳腺癌而言，他们不再是仅用传统的手术放化疗的“三联疗法”，而是根据患者的病理免疫组化等结果，熟练地使用内分泌疗法，生物靶向疗法，基因疗法以及抗血管生成等当今最先进的治疗手段。使乳腺癌的治疗达到了规范化，个体化，综合化。 由于专科化的发展，诊疗水平大大提高。经过长期的手法检查与超声，钼靶X光片，MRI等影象学及组织学穿刺相比较，提高了诊断的经准程度。专业团队长期默契配合以及国内外专家间频繁的技术交流及合作，使乳腺癌保留乳房手术，美容整形手术等等乳腺疾病的整体治疗水平显著提高。 由于专科化的发展，使他们对乳腺疾病的发生，发展以及患病过程中人体及精神等方面发生的变化有更深的认识。增添了心理，康复等方面的疏导和治疗，使临床医疗达到人性化。二．规范化诊疗流程及各种手段联合应用使效果更佳： 当今的乳腺肿瘤治疗提倡规范化治疗、个体化治疗、人性化治疗及综合治疗，这些治疗效果的好坏除取决于治疗理念外，同样也取决于治疗手段的选择。多种先进的治疗手段（如：良性乳腺疾病的美容小切口手术、乳腺癌的保留乳房根治手术、乳房美容整形手术、前哨淋巴结活检术、新辅助化疗、新辅助内分泌疗法、生物靶向治疗、基因治疗、介入治疗、调强放疗、心理疏导治疗、术后和化疗后的康复治疗等）乳腺疾病患者提供了无尽的选择空间、理想的疗效和较高的生活质量。三．服务理念先进、提供个性化、人性化服务： 看病流程的便捷、检查科室集中、医疗环境温馨、医务人员专业知识丰富，态度亲切服务到位。良好的诊疗技术和先进的治疗手段能为患者提供高质量的个体化人性化服务。如：肿瘤晚期的无痛治疗等。 因此，可以说：“乳腺专科能使各具特长的专家及多种新技术，新疗法优化组合，综合其优势为乳腺疾病患者提供早期筛查，提供先进的诊断技术，先进的治疗理念和治疗方法（包括：规范化手术等综合治疗），以及提供出院康复，营养，心理指导等优质的全程温馨服务。以病人的身心健康为中心，使之早日回归社会，正常生活。这些，在非乳腺专科的科室是不易做到的”。

患者：08年9月体检发现双侧左乳增生伴左乳低回声结节 口服中药治疗疼痛缓解 1、我的情况是否严重、需要手术吗？ 2、需要到您的门诊看一下吗? 3、结节较小，有时无法摸到，能手术吗？ 08年9月超生报告：双侧乳房切面形态轮廓正常，层次清楚，腺体回声不均，左乳3点钟，距乳头10mm见5*6mm低回声结节，边界光滑整齐。 CDFI：结节内未见明确血流信号。我一直关注您对其他患者的回复，有的患者情况与我有相似之处，所以我坚持每月一次B超检查对比，半年来结节没有太明显变化，但心理压力过重，恳请您的帮助：盼回复！！！多谢患者：我一直关注您对其他患者的回复，有的患者情况与我有相似之处，所以我坚持每月一次B超检查对比，半年来结节没有太明显变化，但心理压力过重，恳请您的帮助：盼回复！！！多谢铁岭市中心医院乳腺外科常志坤：首先很抱歉没能及时回复，按照你的病史、检查结果增生可能性很大，请保持平和心态，暂时没有手术必要，只要坚持半年左右复查一次即可，如果还是不放心也可以做个钼靶除外一下其他病变，祝早日康复。患者：谢谢您的回复。我会照办的。谢谢