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体外循环下P-选择素与D-二聚体变化的临床研究
吴海军 刘国栋 郑建伟 晋炳申 李征 矫艳 于文舟 姜文斌【摘要】 目的 探讨体外循环对血小板活化及血管内皮细胞损伤的影响及其相互之间的关系。方法 对21例风湿性心脏病患者在体外循环前、中、后5个时点采血。用流式细胞仪检测血小板膜p选择素的表达率及荧光强度,同时用ELISA检测血浆中P选择素及D-二聚体的含量。结果 血小板膜P选择素的表达率从体外循环中15 min开始上升,60 min时达高峰,之后逐渐下降,术后24仍高于术前水平,各时点之间的差异具统计学意义(P<0.01)。血浆P选择素和D-二聚体浓度的变化规律与血小板膜P选择素阳性率基本类似。三者之间Pearson相关系数均大于0.85(P<0.01),呈明显的正相关。而P选择素的荧光强度变化不明显(P>0.01)。结论 随着体外循环时间的延长血小板活化增加,血管内皮细胞损伤加重,且两者之间互为因果。【关键词】 体外循环;P选择素;D-二聚体The relation between P-selection and Plasma D-dimer during extracorporeal circulation Wu Haijun Liu Guodong, et al. Department of Cardiac Surgery, People,Hospital of Weifang. Shandong, 261041,China【Abstract】 Objective To explore the relation between platelet activation and damage of endothelial cells.Methods The blood samples were obtained through venous catheter from 7 patients undergoing elective cardiacoperation for valvular replacement at five different time points during extracorporeal circulation and after extracorporeal circulation. The presence of in vitro platelet activationwas assessed by using flow cytometry to detect the positive rate of P-selection and the fluorescent density on platelet membrane and using ELISA to detemine theplasma levels of P-selectin. ELISA was used to measure plasma level of Plasma D-dimer as the sign of theendothelial cell damage.Results The positive rate of P-selection on platelet membrane and the plasma level of sP-selectin and Plasma D-dimer significantly increased during extracorporeal circulation, with a peak at 1 hour after extracorporeal circulation beginning, and decreased after extracorporeal circulation. The correlation between each other was significant among these three parameters. The change of fluorescent density of P-selection at different time points was tiny.Conclusion With the extracorporeal circulation longthening, platelet activation increases and the damage of the endothelial cells become more obvious. Platelet activation and the damage of the endothelial cells were affected reciprocally.【Key words】 Extracorporeal circulation; P-selectin; Plasma D-dimer 体外循环(extracorporeal circulation)后的非手术性出血严重影响患者的预后。其原因是多方面的,主要与血小板、凝血因子和纤溶系统的异常有关,血小板功能异常被认为是最主要的原因[1]。本研究采用随机分组的方法检测体外循环前后血栓调节蛋白p选择素(P-selection)与D-二聚体(Plasma D-dimer)的表达水平,从而探讨体外循环对血小板活化状况及血管内皮细胞损伤的影响。现报道如下。资料与方法:1.研究对象:2004年7月至2006年7月,我院心外科住院拟行瓣膜置换术的风湿性心脏病患者。病例排除标准:(1)术前红细胞压积(HCT)<30%;(2)心脏射血分数<25%;(3)肾功能不全;(4)肝功能不全;(5)术前凝血功能异常;(6)急诊手术;(7)术前2周内使用过抗凝、抗血小板功能药物。符合上述标准的患者共21例,其中男12例,女9例;年龄(45±13)岁;术前心功能Ⅱ级3例,Ⅲ级4例。体外循环时间(98±32) min;单瓣置换14例,双瓣置换7例,双瓣置换+三尖瓣成形术2例。术后出血量(300±45) ml。2·麻醉和体外循环方法:全部患者采用静脉推注芬太尼加异氟醚吸入麻醉。体外循环采用美国Sarn3000型体外循环机,膜式氧合器,灌流量保持在2~2.5 L·min-1·m-2,灌注压在50~70mmHg (1mmHg=0.133 kPa)。预充液为乳酸林格氏液保持HCT在20%~30%。抑肽酶10 000 U/kg,半量在切皮前静脉滴注,其余量加入预充液。预充液内加入肝素2 000 IU,肝素化剂量为400 IU/kg,使体外循环中部分激活凝血酶原时间(ACT)维持在600 s以上,体外循环停止时用鱼精蛋白中和。3·血样采集:麻醉诱导后切皮前(T1),体外循环开始后15 min(T2),60 min(T3),体外循环停止后4h(T4),24 h(T5)5个时点采集血液。4·检测方法:(1)全血计数:库尔特540血球计数仪测定HCT、血小板计数等。(2)血小板膜P选择素检测:取富血小板血浆(PRP)500μl,1%多聚甲醛1∶10固定后用CD62p(FITC)、CD41a(PE)或非特异性荧光抗体染色(FITC-mouse IgG1、PE-mouseIgG1),流式细胞仪FASCalibur(美国B·D·公司)检测血小板膜P选择素的阳性率及荧光强度的平均值。上述荧光抗体购自美国Pharmingen公司。(3)血浆D-D及血浆P选择素含量检测:血样于-80℃冻存。采用P选择素试剂盒(BMS219,奥地利Bender MedSystems公司)和D-D试剂盒,国产单克隆抗体(上海捷门生物技术公司)。按照试剂说明书操作,BIO-TEK ELx800酶标仪测定吸光度。5·统计学处理:为去除血液稀释对结果的影响用T1的HCT为基准对血小板计数、血浆P选择素及进行矫正,系数为HCTT1/HCTTn。血小板膜P选择素阳性率的数据经平方根反正弦函数转化为正态分布数据后再行分析。各项数据用均值±标准差(-x±s)表示。采用SPSS统计软件包进行单因素方差分析(ANOVA)、两两比较用SNK法、相关分析用Pearson相关系数;P<0.01(双侧)为差异有统计学意义,检验效能>0.8。结果体外循环不同时点的血小板计数、血浆P选择素、D-D、血小板膜P选择素阳性率及其荧光强度的结果见表1。血小板计数在手术开始后立即下降,T2与T3基本保持稳定,随着体外循环的停止逐渐回升,但在术后24小时仍未回到术前水平,其差异有统计学意义(P<0.01)。但经HCT矫正后其差异无统计学意义(P=0.712)。血小板膜P选择素的表达率T1为14.7%,T2开始升高为38.2%,T3达峰值(51.2%),T4略有下降(42.0%),T5降低至21.6%,但仍高于术前水平。5个时点相互之间区别具统计学意义(P<0.01)。而其荧光强度基本保持不变,无统计学意义。血浆P选择素浓度T1为87.7 ng/ml,T2上升为127.8 ng/ml,T3达高峰(200.3 ng/ml),T4、T5逐渐下降。各时点之间相互差异有统计学意义(P<0.01)。血浆D-D含量的时点变化规律与血浆P选择素及血小板膜P选择素阳性率的变化规律相似。从T1的4.85 ng/ml上升至T2的9.59 ng/ml,T3达峰值(16.07 ng/ml),随后下降。血浆D-D、血浆P选择素与血小板膜P选择素阳性率之间存在高度相关(表2)。讨论体外循环后非手术性出血对患者的预后影响很大,其主要原因是血小板质和量的异常[1]。本研究中虽然血小板计数从体外循环开始后即下降,但经矫正后,5个时点之间的差异无统计学意义。其原因可能为:(1)管道的预充液、术中输血或补液使血液稀释,血小板计数下降;(2)膜式氧合器对血小板的影响较小,使血小板的机械性破坏减少;(3)小剂量抑肽酶抑制纤溶酶活性,同时抑制凝血接触系统的激活,与肝素协同阻止凝血酶的生成,从而减少血小板的活化破坏[2]。P选择素属整合素家族成员之一,介导白细胞与活化的血小板和内皮细胞之间的粘附,参与血栓形成与炎症反应,还能促进吞噬细胞对活化血小板的清除。P选择素存在于静息血小板的α颗粒膜上,血小板活化时α颗粒膜迅速与质膜融合使其在血小板膜上表达,是血小板活化的特征性标志之一[3];另外血管内皮细胞的Weibei-Palade小体膜也表达P选择素。由于流式细胞仪能对单个细胞同时进行多参数检测,因而可快速测定血小板膜上P选择素的表达水平,从而判断血小板的活化状况[4]。本研究显示,随着体外循环的持续,血小板膜P选择素的表达率逐渐上升,在体外循环开始后1 h达高峰。但血小板表面的表达强度并无显著增高。提示尽管抑肽酶能减少血小板的活化破坏,但体外循环中血小板的活化仍持续进行。同时,血浆P选择素含量也呈同步变化(两者之间的Pearson相关系数为0.893),提示血浆P选择素主要来源于活化血小板,可能是血小板膜P选择素的脱落部分[5]。D-D是血管内皮细胞的表面蛋白,为凝血酶的受体。血浆中的D-D可能为内皮细胞表面D-D的脱落部分。血浆中的D-D水平与内皮细胞损伤的程度成正比,可作为内皮细胞损伤与微小血栓早期形成的标志[6]。本研究结果显示,体外循环中血浆D-D的水平逐渐上升而术后逐渐下降,提示体外循环通过一定的机制损伤血管内皮细胞。另外,血浆D-D、血浆选择素与血小板膜P选择素表达率三者之间变化规律基本一致,存在明显的相关性。提示体外循环对血小板和血管内皮细胞可能具有类似的影响。其机制有2种可能:(1)体外循环中多种因素导致血小板活化并表达P选择素,而后与内皮细胞粘附并导致后者发生改变;同时内皮细胞也释放出P选择素诱导循环中的白细胞趋化并与内皮细胞粘附从而加重其损伤[7] 。(2)体外循环中,各种因素首先导致内皮细胞受损并释放多种炎症介质,启动并加重血小板的活化,使其表面的P选择素表达增高,同时通过脱颗粒增加使血浆中P选择素增高[8]。我们相信,随着科研的进展,在CPB过程中,必然对纤溶系统-凝血系统有新的认识,对心外科术中、术后减少DIC、微小血栓的形成有极大的帮助。表1不同时点血小板计数、血浆P选择素、D-D、血小板膜P选择素阳性率及其荧光强度(`χ ± s)观察指标 T1 T2 T3 T4 T5FP值血小板*109106.45±45.18111.03±67.67105.5±51.0083.45±46.0879.0±34.7895%可信区间64.77~148.3448.16~173.858.46~155.047.32~119.0944.95~120.80.5330.712血浆P选素(ng/ml)87.70±2.8121.78±5.6200.27±5.0152.63±3.5116.11±3.895%可信区间85.09~90.3116.55~127.0195.63~204.9149.35~155.9112.55~119.6693.09<0.001D-D(mg/L)0.28±0.010.74±0.093.15±2.885.50±3.084.64±2.2395%可信区间0.27~0.290.66~0.820.67~6.002.33~8.442.34~6.8334.07<0.001血小板膜P选择素阳性率*0.394±0.010.666±0.0230.798±0.020.705±0.020.483±0.0195%可信区间*0.378~0.4080.645~0.6860.772~0.8280.684~0.7290.468~0.48419.67<0.001血小板膜P选择素强度(道数)26.83±7.923.61±4.420.72±5.5021.74±4.216.54±6.8595%可信区间19.46~34.219.46~27.715.84~25.817.82~25.610.21~22.872.80<0.05注:*该组数据为经平方根反正弦函数转换后的值表2血小板膜P选择素阳性率及强度、血浆P选择素、D-D和血小板计数的Pearson相关系数血浆P选择素D-D荧光强度血小板计数血小板膜P选择素阳性率0.881*0.934*-0.090.078血浆P选择素0.962*-0.18-0.001D-D-0.2030.023荧光强度0.047注:*Pearson相关系数的P<0.01参考文献1.熊立房,王宏利,体外循环及人工瓣膜人工心脏中止凝血异常。见:王振义主编。血栓与止血基础理论与临床。第二版,上海科技出版社,1996. 560-566。2 .HuangH, Ding W, Su Z, et al. 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