西安交大附属二院呼吸与危重症医学科科普号

呼吸内科 牛泽群 硕士研究生 杨拴盈 教授慢性肺源性心脏病简称慢性肺心病，是我国的一种常见病。东北、西北、华北地区患病率高于南方地区，农村患病率高于城市，并随年龄增高而增加。冬季气候干燥、寒冷，极易诱发呼吸道感染，使肺心病加重和恶化。因此，肺心病患者做好预防工作，对安全过冬尤为重要。第一：防止上呼吸道感染上呼吸道感染是肺心病急性发作的主要诱因。因此，肺心病患者应严防上呼吸道感染。平时要加强锻炼，多到户外空气新鲜的环境中练习深呼吸，吹口哨，缩唇呼吸，以改善呼吸肌力量，增加肺活量，增强机体免疫力；注意御寒，防止冷空气刺激；随气候变化增减衣物，以免引起感冒而加重病情。此外冬季还应注意居室的温度、湿度，定时开窗通风，保持空气流通新鲜。第二：保持呼吸道通畅通气障碍是肺心病加重的主要因素。所以，必须设法保持呼吸道通畅。痰咳不出，会加重呼吸道阻塞；多饮水、热蒸汽或雾化吸入有利于湿润呼吸道，稀释稠痰；多活动、有意识咳嗽等均有利于痰液排出。当然，配合服用氨溴索等化痰药物效果更好。第三：家庭吸氧治疗吸氧可明显减缓肺心病的进展，降低肺动脉压力，减少肺心病病死率，是迄今延长肺心病患者生存时间最可靠的方法之一。肺心病加重期的氧疗原则是：长期、持续、低流量（1~23升/分钟）吸氧。一般应持续每天14小时以上，间歇应在白天，睡眠时不要间断。近年，吸氧疗法已普及到家庭。第四：加强饮食调养肺心病人呼吸所消耗的能量要比正常人大，又因内脏淤血、水肿而食欲差，吸收又不佳。所以，多数病人营养不良，体重减轻，低蛋白血症，免疫力低下，容易导致感染，加重病情，以此形成恶性循环。因此，调节肺心病的饮食营养是十分重要的。应给病人以优质蛋白（蛋、奶、鱼等）及富含维生素、纤维素、易消化的饮食（如水果和蔬菜等），不要过度限盐，因为低盐可加重乏力、食欲不振，甚至恶心、呕吐，加重营养不良。但有水肿及心功能不全的病人应控制食盐量，以免加重呼吸和心脏负担。当然，保持大便通畅对于肺心病患者也是很重要的。如果条件许可，可在医师指导下服用冬虫夏草、胸腺肽等，可提高免疫力，香菇、菌类对提高免疫力也有一定的作用。第五：发病及时治疗肺心病急性发作或病情加重时，应在医生指导下及时治疗，避免病情进一步加重，并加强护理。

南岩东1 杨拴盈2 金发光1 田应选3 霍淑芬2 杜洁4（1.第四军医大学唐都医院呼吸内科，西安 717308；2. 西安交通大学第二附属医院呼吸内科，西安 710004；3.陕西省人民医院老年呼吸科 710068；4.陕西省人民医院内科 710068）摘要：目的：应用高通量蛋白质组学及生物信息学技术分析肺鳞癌表达蛋白质谱，筛选肺癌标志蛋白质，为肺鳞癌发病机制、早期诊断及治疗提供有价值的线索。方法：6例手术后新鲜肺鳞癌组织，通过激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）分离纯化肿瘤细胞并提取可溶性总蛋白；多维液相色谱-离子阱串联质谱技术(也称鸟枪法蛋白质组学，shot-gun proteomics)对蛋白质进行分离、鉴定；进一步通过生物信息学工具预测肺鳞癌细胞表达蛋白质的理化性质、分子功能、生物通路及蛋白质相互作用，并筛选潜在的标志蛋白。结果：LCM共收集60个cap，平均每个LCM-cap收集感兴趣细胞数约12000个，其同质性大于95％。可溶性总蛋白经多维液相色谱-离子阱串联质谱共鉴定出860个非冗余蛋白质。蛋白质的理化性质包括分子量、等电点、平均疏水性、跨膜结构域、亚细胞定位、转录后修饰和组织分布经过在线生物信息学工具分析；蛋白质生物学功能基于GO软件和KEGG生物学通路分析，根据其注解，筛选出3个有价值的蛋白质，即分裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MHPK），粘联素A1（annexin A1，ANXA1），高移动组蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGPB1）作为肺鳞癌候选的标志蛋白。结论：鸟枪法蛋白质组学可大规模分离、鉴定肿瘤细胞表达蛋白质，基于生物信息学筛选的标志蛋白质可能成为肺癌诊断和治疗的分子靶点。关键词：肺鳞癌；鸟枪法蛋白质组学；生物信息学；分子功能；标志蛋白质ABSTRACT: Objective To explore the pathogenesis and screen biomarkers of early diagnosis and treatment for lung squamous cell carcinoma (SQCC).Methods: Tumor cells were isolated and purified bylaser capture microdissection（LCM）from 6 cases of fresh tissue of lung SQCC after operatoin and total solution proteins were extracted. Proteins were isolate and identified by mutiple dimension liquid chromatography (MDLC) and ion trap tandem mass spectrum technology (Shot-gun Proteomics) . The physio-chemical properties, molecular functoin, biological pathway and interaction of the expressoin proteins were predicted and biomarkers were screened using bioinformatics tools. Results: A total of 60 LCM-caps were collected and about 12000 cells were harvested from every LCM-cap. 860 non–redundant proteins were identified using shot-gun proteomics technology. The physio-chemical properties, including molecular weight (MW), point of isoelectric (PI), grand average of hydropathy (GRAVY), trans-membrane helices (TMH), subcellular location, post-transcription modification (PTM) and tissue distribution were analyzed using bioinformatics tools online and were further indiciated in statistical graph. Biological function was analyzed based on gene ontology (GO) software and kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) biological pathway. Three valuable proteins, including mitogen-activated protein kinase (MHPK), annexin A1 (ANXA1) and high mobility group protein B1(HMGPB1) were screened candidate biomarkers of lung SQCC according to functoin annotatoin.Conclusoin: Shot-gun proteomics can globally isolated and identified the expression protein of tumor cell. The screened biomarkers based on bioinformatics may become molecular target point of dianosis and treatment for lung cancer . KEY WORDS: lung squamous cell carcinoma; shot-gun proteomics; bioinformatics; molecular function; biomarker protien肺癌目前已成为世界范围内发病率最高的恶性肿瘤，缺乏有效的早期诊断及治疗措施，5年生存率不足15％[1]。因此，阐明肺癌发生的分子机制，寻找其特异性靶向蛋白已成为肺癌研究的一项迫切任务。为了大规模、全景式和从整体的角度探索肺鳞癌细胞全蛋白表达谱，我们采用了激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）、多维液相色谱-离子阱串联质谱技术(也称鸟枪法蛋白质组学，shot-gun proteomics)对6例肺鳞癌细胞表达蛋白质进行分离、鉴定，进一步通过生物信息学工具预测肺鳞癌细胞表达蛋白质的理化性质、分子功能、生物通路及蛋白质相互作用，并筛选出的3个潜在的标志蛋白，为肺鳞癌发病机制、早期诊断及治疗提供有价值的线索。1 资料与方法1.1 临床资料 从2005年2月至2007年2月共收集6例肺鳞癌患者肿瘤组织，所有患者均具有完整的临床资料、术前未行放疗及化疗、经手术切除、病理证实。其中男5例，女1例； 年龄47-70岁；肿瘤P-TNM分期：Ia期1例, Ib2例, IIb期3例；肿瘤分化：高分化1例，中分化3例，低分化2例。1.2 主要仪器 冰冻切片机（MICROM/HM5000，德国）；Pixcell激光捕获仪（ARCUTUROUS Inc，美国）；分光光度仪（P-2000,Hitachi公司），纯水装置（Millpore公司），质谱仪（LTQ），MDLC（GE Healthcare）。1.3 主要试剂 所有缓冲液均用Milli-Q 水（Millipore, Bedford, MA, USA）配制。二硫苏糖醇（DTT）、尿素（Urea）、3-胆酰胺丙基－二乙铵－丙磺酸（CHAPS）、三羟甲基氨基乙烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）、Bradford 法定量液等试剂购自Bio-Rad公司（Hercules, CA, USA）；碘代乙酰胺（IAA）、过硫酸铵（Ammonium persulphate）、甲酸（Formic acid, FA）、胍（Guanidine）、氯化钠（NaCl）等试剂购自Sigma公司（St. Louis, MO, USA）；HPLC级别乙腈（ACN）和甲醇（Methanol）购自Fisher公司（Fair Lawn, NJ, USA）；三氟乙酸（TFA）购自Merck公司（Schuchardt, Hohenbrunn, Germany）；氢氧化钠购自Fisher（Merck，Darmstadt，German）公司；胰蛋白酶（Trypsin，sequencing grade）购自Promega公司（Madison, WI, USA）。1.4 组织标本的处理 带消毒手套，用无菌剪刀剪取手术后新鲜（30分钟内）肺肿瘤组织，大小约0.4m3，生理盐水反复清洗去除血液，并剪去坏死组织。处理后的组织立即置于-80 ℃保存。1.5 LCM 将组织移入-28℃冰冻切片机，OCT包埋；冰冻切片一张（10mm），常规H＆E染色，光学显微镜下观察，确定组织无明显炎症、坏死；对余下的组织冰冻切片（8mm），改良H＆E染色，其方法是：将试剂瓶置于冰上，苏木精1s，蒸馏水洗10s（缓慢），伊红10s，85％乙醇10s，90％乙醇10s，无水乙醇Ⅰ10s，无水乙醇Ⅱ10s，二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ2min；改良H＆E染色后的组织切片立即行LCM，条件为：光束直径7.5um，脉冲持续时间15.5ms，光束能量80mW，每张切片捕获时间不超过40分钟。1.6 蛋白质提取及定量 每个LCM cap上的细胞，加裂解液（9.5M尿素，65mM DTT，4%CHAPS，0.2%IPGbuffer，裂解液和酶抑制剂以体积比50：1混合）约20l，吹打cap表面裂解细胞10次，转入离心管中。依次操作组内所有cap，合并在一个离心管中，总体积控制在200 l左右。超声破碎细胞（80W，5次，每次10秒，间隔15秒，冰上完成）。离心，15,000g，45分钟，取上清，加入5倍体积的纯丙酮（-20℃），沉淀蛋白质，去除染色剂。沉淀蛋白质复溶于适量的裂解液中，Bradford法定量，分装成100g/管，置于500l离心管中，-80℃保存。 1.7 蛋白质质谱鉴定 取100g加trypsin，trypsin : protein=1：20-1：50，37℃，20hr； 离心12,000 rpm，4℃，90min， -80℃保存。使用MDLC-LTQ进行分析，C18柱（0.15mm直径，15cm长），自动进样器上样，样品经过C18Trap柱脱盐，然后在C18柱上进行分离（A相为0.1% FA的Millpore水，B相为0.1%FA 84%乙腈水溶液，梯度为2小时内从4%的B相上升到50%的B相），microspray模式。质谱扫描条件设定为一个400—2000的全扫描 (full scan) 后面进行全扫描中前3个最高峰的MS/MS扫描，其中动态排除 (dynamic exclusion)的设定是：重复次数(repeat count)为1，重复容忍时间 (repeat duration)为0.5 min，动态排除时间 (exclusion duration)为3.0 min。1.8 数据库查询 产生的MS/MS用TurboSEQUEST BioWorksTM 3.0软件自动搜索IPI人类蛋白质数据库，所有鉴定得到的肽段数据必须满足以下一些条件：(1) charge=1，XCorr=1.9； charge=2，XCorr= 2.2； charge=3，XCorr= 3.75；(2) Delta Cn= 0.1。同时在Swiss-Prot/TrEMBL和NCBI数据库查询蛋白质，比较不同数据库查询结果。1.9 生物信息学分析 蛋白质分子量（molecular weight, MW）、等电点（piont of isoelectric, PI）、平均疏水性（grand average of hydropathy, GRAVY）通过蛋白质组学网(http://www.expasy.org/tools) 蛋白质专家分析软件（expert proteins analysis system, ExPASy）分析；跨膜结构通过TMHMMv2.0 (http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0) 软件预测；亚细胞定位基于pTARGET软件（http://bioapps.rit.albany.edu/pTARGET）分析；转录后修饰（post-transcription modification，PTM)，包括GPI锚定糖基化（GPI Anchor Glycosylation），O-糖基化，N-糖基化及磷酸化分别通过在线Big-PI Predictor, NetNGlyc 1.0 Server, NetOGlyc3.1 Server和GPS2.0分析。蛋白质功能分类包括分子功能，细胞组分、生物学进程基于Gene Ontology (GO)注解软件（http://http://www.ebi.ac.uk/GOA/）分析。蛋白质生物学通路依赖于kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html）软件分析，并根据其注解，确定与肿瘤发生密切相关的关键信号通路，初步筛选肺鳞癌标志蛋白质。2 结果2.1 蛋白质定量：6例肺鳞癌组织标本经LCM共收集60个cap，平均每个LCM-cap收集感兴趣细胞数约12000个；高倍光学显微镜观察，LCM-cap上肺鳞癌细胞的同质性大于95％。分别于丙酮沉淀前后，先对单个LCM cap上细胞提取的蛋白质行Bradoford法定量，然后对总共60LCM cap上细胞提取的蛋白质行Bradoford法定量，其结果如表1。表1 丙酮沉淀前后可溶性蛋白质定量结果丙酮沉淀单个cap蛋白质 (g) ( ±s)总蛋白（g）前4.14±0.36248.20后1.69±0.12101.892.2 蛋白质鉴定：使用MDLC，C18Trap柱脱盐，分离2小时，获得了LCM肺鳞癌细胞表达蛋白质酶解肽段的总离子流图。LC分离后的混合肽段，经电喷雾离子阱串联质谱，先由第一级质量分析器获得其一级质谱图，然后在一级质谱图中挑选出需要进一步分析的母离子进入碰撞室碰撞诱导解离(collision- induced dissociation, CID)，产生碎片离子获得二级质谱图，并鉴定出该肽段氨基酸序列。原始数据使用BioworksTM软件查库（人类）为了避免冗余，我们采用了较严格的过滤参数charge=1，XCorr=1.9；charge=2，XCorr=2.2；charge=3，XCorr=3.75；同时应用Swiss-Prot/TrEMBL and NCBI验证结果，最终又通过删除同源蛋白的方法，共鉴定出860个非冗余蛋白质（不包括角蛋白），所有蛋白质至少有1个唯一肽段，部分蛋白质的唯一肽段数达10个。2.3 蛋白质理化性质：我们通过生物信息学工具总结了肺鳞癌细胞表达蛋白质各种理化性质。图1显示了鉴定蛋白质MW分布从最小3.0KD至最大3800.5KD，其中120（10%）个蛋白质MW小于20KD，80（8%）个蛋白质MW大于100KD；而且，50（8%）个MW极大（MW>200KD）或极小（MW<10KD）蛋白质也被鉴定。PI的分布（图2）从2.0至14.0，15（8%）个极酸（PI<4.0）20个（14%）极碱（PI>10）蛋白质被鉴定。GRAVY通过Kyte-Doolittle模型来计算（图3），12（10%）个蛋白质具有疏水性，30（20%）个蛋白质具有亲水性。对于蛋白质的TMH预测如图4所示，共150个蛋白质具有跨膜a螺旋，其中50（7.0%）蛋白质有1个跨膜区，22（6.0%）个蛋白质有2个跨膜区，跨膜区大于等于3的蛋白质数目为56（20%）个。鉴定蛋白质亚细胞定位通过pTARGET算法预测，如图5所示，胞浆蛋白数目为260（30%）个，其它蛋白质分别位于内质网（100，10%）、高尔基复合体（100，10%）、线粒体（100，10%）、细胞核（100，10%）、细胞膜（100，10%）。PTM分别为：3个蛋白质具有GPI锚定糖基化，102个蛋白质具有N-糖基化，113个蛋白质具有O-糖基化，58个蛋白质具有磷酸化（图6）。鉴定蛋白质除分布于肺组织外，部分蛋白质还分布于骨髓、脑、直肠、心脏、肝脏等组织（图7）。2.4 蛋白质功能分析：基于GO软件对蛋白质功能分析显示，鉴定的860个蛋白质对应于一种或者一种以上的分类注释，分子功能方面（图8），264个蛋白质具有催化活性（catalytic activity），9个蛋白质具有运动活性（motor activity）, 18个蛋白质具有翻译调节活性（translation regulator activity）,65个蛋白质具有结构分子活性（structural molecule activity）, 42个蛋白质具有转运活性（transporter activity）, 51个蛋白质具有酶调节活性（enzyme regulator activity）, 40个蛋白质具有转绿调节活性（transcription regulator activity）, 8个蛋白质具有抗氧化活性（antioxidant activity）, 28个蛋白质具有分子转导活性（molecular transducer activity）；生物进程分析结果（图9）为18个蛋白质具有生长功能（growth）, 6个蛋白质具有细胞杀伤功能（cell killing）, 177个蛋白质具有细胞定位功能（localization）,9个蛋白质具有定位修复功能（maintenance of localization）等。将本研究中鉴定的蛋白质定义为测试集，全人类蛋白质组定义为参考集，通过超几何分布蛋白质富集分析表明，480个蛋白质富集在30个GO分类注释，并在肺鳞癌细胞中显著高表达（P<0.05或P<0.01）（图10）。其中一些具有细胞增殖、细胞粘附、信号转导、凋亡、抗氧化功能的蛋白质与肿瘤的发生、侵袭密切相关。进一步KEGG生物通路搜索发现，3个蛋白质，即分裂素活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MHPK），粘联素A1（Annexin A1，ANXA1），高移动组蛋白B1（High mobility group protein B1，HMGPB1）涉及凋亡通路，p53信号通路，泛素介导的蛋白酶通路，可以作为肺鳞癌候选的标志蛋白（图11）。3．讨论目前肿瘤蛋白质表达谱有两个互补的研究策略[2]：差异蛋白质表达谱和全蛋白表达谱。差异蛋白质表达谱主要是指细胞或组织在不同条件下的蛋白质表达谱的差异分析（differences in protein expression）；全蛋白表达谱（global protein profiles）侧重检测一个细胞或组织里蛋白质的表达情况，是针对细胞或组织的全部蛋白质，也就是着眼于整个蛋白质组或某一亚单位蛋白质组。Celis等[3]用2-DE分析数百个膀胱癌患者标本的蛋白质表达情况，建立了膀胱癌的蛋白组数据库，并注释蛋白质的生物学特性及与疾病进程的关系，这是目前所能获得的最大的和注释最好的数据之一。Ou等[4]对人肝癌细胞系HCC-M蛋白表达进行分析鉴定，建立HCC-M蛋白质表达数据库。此外，结肠癌、乳腺癌、白血病等肿瘤的细胞系或肿瘤组织的数据库也已经发布[5，6]。这些数据为肿瘤的深入研究提供了丰富的资源。肺癌由于组织成分复杂、病理类型多样、细胞异质性明显，因此样品制备是全蛋白表达谱研究的关键。本研究中，我们采用LCM技术，从肿瘤组织中特异性分离出实质细胞，提取可溶性总蛋白质，分别于丙酮沉淀前后定量分析。结果显示，无论单个cap的蛋白质量还是总蛋白量，丙酮沉淀前后均明显差异，提示丙酮沉淀方法对可溶性蛋白质有一定的影响，如何既能使丙酮与染色剂充分结合，又不致丢失蛋白质，这一问题将有待深入研究。尽管如此，其蛋白质量仍然可以满足shot-gun蛋白质组学上样的要求。Shot-gun蛋白质组学技术具有高效、快速、自动化、低检测限等优点，所获蛋白质图分辨率高、重复性好，有效克服了2-DE操作费时费力，对于极端酸性、碱性、极难溶解的、疏水性膜蛋白及分子量很高或很低的蛋白质难以分离的缺点。本研究通过多维液相色谱技术对肺鳞癌细胞表达蛋白质酶解肽段分离，获得了总离子流图；分离后的肽段经电喷雾、离子阱串联质谱获得其一、二级质谱图。我们采用了比较苛刻的数据筛选和过滤条件，最终又通过删除同源蛋白的方法，共鉴定出860个蛋白质。肽段分析显示，大部分鉴定蛋白质的唯一肽段数大于1，部分蛋白质的唯一肽段数超过10个，表明鉴定蛋白质结果是可靠的。虽然目前从生物学功能的角度来说，关于究竟是低丰度蛋白还是高丰度蛋白更有意义仍然在争论之中，但是首先大规模尽可能多地鉴定出细胞表达的蛋白质是解决这些争论最基本的前提。由于蛋白质存在翻译后的修饰，使蛋白质数量和种类远远大于相应的基因组的基因数量，而且蛋白质功能与其空间定位密切相关，蛋白质彼此相互作用、相互影响，使研究蛋白质的复杂性远远超过了基因组研究[7]。目前，大规模蛋白质组表达谱研究及功能分析一般采取基于数据库搜索的策略。本研究中鉴定蛋白质的分子量、等电点、疏水性、跨膜结构域等理化性质，通过统计图形直观的显示了其分布特征。功能分析采用了国际蛋白质注解的标准方案GO， KEGG生物通路，结果表明860个蛋白质可分为9类分子功能和10类生物学进程，共参与了30个KEGG生物学通路。其中对参与细胞增殖、粘附、信号转导、凋亡等与肿瘤发生密切相关的信号通路的分析，初步筛选出3个有价值的肺鳞癌标志蛋白质，分别是MHPK, ANXA1, HMGPB1。MHPK活化蛋白激酶属于蛋白激酶超家族，通过磷酸化转录因子来启动和调节分化细胞的减数分裂、有丝分裂和分裂后期的功能。Zhao等[8]发现HeLa细胞系中RNAi介导的LIV-1明显抑制肿瘤细胞的增殖、克隆、转移及侵袭的能力，而LIV-1抑制伴有p44/42 MAPK、phospho-p44/42 MAPK表达水平的下调。研究表明，LIV-1 mRNA在宫颈癌原位过表达，通过靶向的MAPK 介导宫颈癌细胞侵袭。Yoo等[9]发现头颈部鳞癌细胞系HN6和HN30通过口服抗肿瘤活性药物BMS-275183紫衫烷，MAPK表达水平可以下降。ANXA1属钙结合蛋白，是血小板源生长因子、胰岛素生长因子、肝细胞生长因子及散射因子的受体酪氨酸激酶激酶；同时其作用也涉及到花生四烯酸的代谢和表皮生长因子受体酪氨酸激酶途径。ANXA1的表达已在各种肿瘤被发现，其中上调的有胰腺癌，乳腺癌、肝癌、胃癌；表达下调的有前列腺癌、食管鳞癌。ANXA1在肿瘤形成的作用可能具有组织特异性[10]。HMGPB1是一个与癌症相关的多功能的细胞因子，高表达的HMGPB1导致了许多肿瘤细胞的增殖和转移，如乳腺癌、大肠癌、黑色素瘤等。Akaike等[11]发现胃癌细胞系中HMGPB1表达与肿瘤微环境中巨噬细胞的浸润呈正相关，并调节肿瘤微环境的炎症反应。Kuniyasu H等[12]发现HMGB1可能通过细胞间信号转导诱导巨噬细胞的生长抑制和凋亡。总之，本研究应用shot-gun蛋白质组学研究策略，全景式分离、鉴定出肺鳞癌细胞蛋白质表达谱，进一步通过生物信息学对表达蛋白质谱理化性质和生物学功能进行分析，筛选出3个候选的标志蛋白质，有望作为肺鳞癌诊断、治疗的靶点。当然，进一步对其灵敏度、特异度及阳性预测值的研究仍然是必需的。参考文献[1] 杨拴盈，杨德昌．肺癌诊断及治疗进展[J]．中华结核和呼吸杂志，2004，27 (1)：18-19．[2] Simpson RJ, Dorow DS. Cancer proteomics: from signaling net-works to tumor markers[J]. Trends Biotechnol, 2001, 19 (10 Sup-Pl):40-48.[3] Celis JE, Ostergaard M, Rasmussen HH,et al. A comprehensive protein resource for the study of bladder cancer: http://biobase.dk/cgibin/celis [J]. Electrophoresis, 1999,20 (2):300-309.[4] Ou K, Seow TK, Chung MC, et al. Proteome analysis of a human heptocellular carcinoma cell line, HCCM: An update [J]. Electrophoresis, 2001, 22 (13):2804-2811.[5] Srinivas PR, Kramer BS,Srivastava S. Trends in biomarker research for cancer detection[J]. Lancet Oncol, 2001, 2 (11):698-704.[6] Simpson RJ, Dorow DS. Cancer proteomics: from signaling net-works to tumor markers[J]. Trends Biotechnol, 2001, 19 (10 Sup-Pl):40-48.[7] Kremer A, Schneider R, Terstappen GC. A bioinformatics perspective on proteomics: data storage, analysis, and integration. Biosci Rep. 2005;25: 95–106.[8] Zhao L, Chen W, Taylor KM, et al. 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大家对于呼吸介入可能不了解。各种原因引起的气道结构或气道内异物，比如良恶性疾病所致气道狭窄狭窄，气道异物，肺部结节需要明确性质等，可严重影响患者的生活质量，甚至危及生命。呼吸介入可借助于先进的支气管镜系统快速解决这一问题，创伤小，费用低，方便快捷。

慢性肺源性心脏病简称慢性肺心病，是我国的一种常见病。东北、西北、华北地区患病率高于南方地区，农村患病率高于城市，并随年龄增高而增加。冬季气候干燥、寒冷，极易诱发呼吸道感染，使肺心病加重和恶化。因此，肺心病患者做好预防工作，对安全过冬尤为重要。一、肺心病患者防止上呼吸道感染。上呼吸道感染是肺心病急性发作的主要诱因。因此，肺心病患者应严防上呼吸道感染。平时要加强锻炼，多到户外空气新鲜的环境中练习深呼吸，吹口哨，缩唇呼吸，以改善呼吸肌力量，增加肺活量，增强机体免疫力；注意御寒，防止冷空气刺激；随气候变化增减衣物，以免引起感冒而加重病情。此外冬季还应注意居室的温度、湿度，定时开窗通风，保持空气流通新鲜。二、肺心病患者保持呼吸道通畅。通气障碍是肺心病加重的主要因素。所以，必须设法保持呼吸道通畅。痰咳不出，会加重呼吸道阻塞；多饮水、热蒸汽或雾化吸入有利于湿润呼吸道，稀释稠痰；多活动、有意识咳嗽等均有利于痰液排出。当然，配合服用氨溴索等化痰药物效果更好。三、肺心病患者要进行家庭吸氧治疗。吸氧可明显减缓肺心病的进展，降低肺动脉压力，减少肺心病病死率，是迄今延长肺心病患者生存时间最可靠的方法之一。肺心病加重期的氧疗原则是：长期、持续、低流量（1~23升/分钟）吸氧。一般应持续每天14小时以上，间歇应在白天，睡眠时不要间断。近年，吸氧疗法已普及到家庭。四、肺心病患者加强饮食调养。肺心病人呼吸所消耗的能量要比正常人大，又因内脏淤血、水肿而食欲差，吸收又不佳。所以，多数病人营养不良，体重减轻，低蛋白血症，免疫力低下，容易导致感染，加重病情，以此形成恶性循环。因此，调节肺心病的饮食营养是十分重要的。应给病人以优质蛋白（蛋、奶、鱼等）及富含维生素、纤维素、易消化的饮食（如水果和蔬菜等），不要过度限盐，因为低盐可加重乏力、食欲不振，甚至恶心、呕吐，加重营养不良。但有水肿及心功能不全的病人应控制食盐量，以免加重呼吸和心脏负担。当然，保持大便通畅对于肺心病患者也是很重要的。如果条件许可，可在医师指导下服用冬虫夏草、胸腺肽等，可提高免疫力，香菇、菌类对提高免疫力也有一定的作用。五、肺心病患者发病要及时治疗肺心病急性发作或病情加重时，应在医生指导下及时治疗，避免病情进一步加重，并加强护理。

侯彦丽 硕士研究生 杨拴盈教授慢性阻塞性肺疾病（COPD）主要包括慢性支气管炎、阻塞性肺气肿，临床上主要表现为慢性咳嗽，咳痰，气短或呼吸困难及喘息和胸闷等。COPD患病率和病死率均较高，由于肺功能进行性减退，严重影响患者的劳动力和生活质量。自2002年起，全球COPD创议组织(GOLD)倡议将每年11月第三周的周三定为“世界COPD日”。 一场普通的感冒就会使COPD患者“雪上加霜”，而老年患者更易出现急性反复发作，故冬季来临之际，对COPD的防治应注意以下方面：1.长期氧疗：应该每日吸氧至少14小时，使动脉血氧分压至少达到60mmHg才能获得较好的氧疗效果。夜间进行氧疗可以预防夜间低氧血症，减低COPD患者夜间猝死率。2．每天步行锻炼：平路匀速步行，每次累计运动时间至少30分钟，每周不少于5次，步速应循序渐进。3．坚持呼吸体操：主要有腹式呼吸和缩唇呼吸。腹式呼吸：患者双手分别放在前胸和腹部，尽量用鼻吸气，同时挺腹，用口呼气，同时收腹。缩唇呼吸：呼吸时将双唇如吹口哨状缩拢，使呼出的气体通过缩窄的口型缓慢的呼出，一般呼气所用的时间要长于吸气。4.科学饮食：COPD患者冬季饮食应做到保温、御寒、防燥。食用富有优质蛋白质的食物有肉类、蛋类、鱼类及豆制品等。特别怕冷的人，可以多补充些根块和根茎类的蔬菜，如胡萝卜、藕及薯类等。而从饮食中补充维生素B2和维生素C亦十分必要。5．注重环境:保持病室内恒定的温度、湿度有益于痰液的排出和呼吸道的畅通。尤其在冬季空调、暖气的使用，室内空气特别干燥，可使用加湿器、空气清洁器、亦可用湿毛巾等方法增加室内湿度。6．戒烟、加强疾病了解等。以保持良好的心态为原则，加强自我保护，要注意防寒保暖，预防感冒，避免在受污环境下长期停留。要多了解COPD的相关知识，并注意天气变化、避免感染和戒烟。如出现了一些COPD的症状，应及时去医院就诊，做肺功能检查进行COPD的诊断。

刘延峰1 杨渭临2 杨拴盈1 尚文丽1 程西安3 张薇1 郑华东2 杜洁1 霍树芬1 章琳2 卜丽娜1 田应选1 南岩东11西安交通大学医学院第二附属医院呼吸科 西安 7100042西安交通大学医学院第二附属医院老年呼吸科3陕西省铜川市人民医院呼吸内科 通讯作者: 杨拴盈 Tel:13991392919; email: yangshuanying66@163.com【摘要】 目的 评价CYFRA21-1对非小细胞肺癌早期诊断的价值。方法 收集已公开发表的有关CYFRA21-1对非小细胞肺癌诊断价值的临床研究，按Meta分析的要求对检索到的原始研究的质量进行评估，对符合条件的所有研究结果进行Meta分析。结果 共纳入6篇文献，其中中文4篇，英文2篇，样本量为398例，其中经病理学确诊的Ⅰ—Ⅲa期NSCLC为140例，异质性检验显示纳入研究齐性较好，通过确定模型的汇总计算得出汇总敏感度为35%（24%-44%），汇总特异度为96%（92%-98%），汇总阳性预测值为7.52（4.07-13.90），汇总阴性预测值为0.66（0.49-0.89），SROC曲线下面积为0.94。结论 CYFRA21-1对非小细胞肺癌有一定的早期诊断价值，可作为较重要的参考指标之一，但需要更多高质量、大样本、多中心的研究加以验证。【关键词】 CYFRA21-1 非小细胞肺癌 Meta分析Meta-analysis on Diagnostic Value of CYFRA21-1 in Early Stage Non-small Cell Lung Cancer 【Abstract】 Objective To evaluate the diagnostic Value of CYFRA21-1 in early stage non-small cell lung cancer. Methods All published clinical studies which evaluated the diagnostic value of CYFRA21-1 in non-small cell lung cancer were reviewed. The retrieved original studies were evaluated according to the requirements of Meta-analysis. Meta-analysis was used in all eligible results. Results Six data including 4 in Chinese and 2 in English were collected. The sample volume was 398, of which 140 cases confirmed by pathology was inⅠ-Ⅲa period of NSCLC. Heterogeneity test showed that the homogeneity of the study was good. By using deterministic models to analyze the data, the value of the weighted sensitivity was 35%（24%-44%）, the specificity was 96%（92%-98%）, the positive likelihood ratio was 7.52（4.07-13.90）, negative likelihood ratio was 0.66（0.49-0.89）, and the SROC area under the curve (AUC) was 0.94. Conclusions CYFRA21-1 could be regarded as one of the valuable reference tests in early stage NSCLC, but more high quality, lager sized, prospective studies are required to evaluate its clinical value. 【Key Words】 CYFRA21-1 Non-small cell lung cancer Meta-analysis CYFRA21-1是细胞角蛋白19的可溶性片段，目前主要用做肿瘤标志物，对肺癌的诊断有较大意义。细胞角蛋白（cytokeratins)是形成上皮细胞的结构蛋白之一中间丝的亚单位。根据其分子量和双向电泳中等电点的不同，可以分为20 种不同类型。它们被分为两个亚群：Ⅰ类(酸性蛋白), Ⅱ类(碱性蛋白)。细胞角蛋白是由Ⅰ类和Ⅱ类角蛋白组成的异聚合体。细胞角蛋白19（CYK-19) 是一分子量约40，000 Da的Ⅰ类角蛋白（酸性蛋白）,是角蛋白家族中最小的成员。CYK-19广泛分布在正常组织表面,如层状或鳞状上皮中。在恶性上皮细胞中,激活的蛋白酶加速了细胞的降解,使得大量细胞角蛋白片段释放入血,其可溶性片段可与两株单克隆抗体KS19.1和BM19.21特异性结合,故称为CYFRA21-1[1] 。CYFRA21-1目前被认为是一种主要用于检测肺癌的肿瘤标记物，尤其对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC)的诊断具有重要价值，各类NSCLC阳性检出率为50%～85%。CYFRA21-1的血清浓度水平高低与肿瘤临床分期正相关[2]，也可作为肺癌手术和放化疗后追踪早期复发的有效指标。CYFRA21-1的血清高浓度水平提示疾病处于进展期和预后不良。治疗成功的标志是CYFRA21-1的血清浓度迅速下降，反之则表示病灶未完全清除。血清水平下降后又升高，则提示疾病复发。近年来对CYFRA21-1在NSCLC诊断中的作用进行了大量研究，对其在早期诊断NSCLC中的价值作出了不同程度的肯定，然而独立研究的样本量较少，有一定的局限性，CYFRA21-1阴性也不能排除存在肺癌的可能。因此，为了正确、科学的评价CYFRA21-1对非小细胞肺癌早期诊断的价值，我们收集公开发表的相关文献进行Meta分析。1 资料与方法1．1 纳入与排除标准1．1．1 研究类型 关于诊断准确性的诊断性试验；可提取四格表数据；限于以英文和中文发表的文献。1．1．2 研究对象 肺癌患者、肺部良性病变患者，肺癌患者全部经病理组织学证实，临床分期限于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa期。1．1．3 诊断试验方法 CYFRA21-1的检测应用商业化试剂。1．1．4 测量指标 合并敏感度 (SEN)、合并特异度(SPE)、合并阳性似然比(PLR)、合并阴性似然比(NLR)、合并SROC曲线下面积。1．1．5排除标准：（1）文摘、讲座、述评及综述类文献。（2）对照组包括正常人群。（3）NSCLC患者全部或部分未经病理证实。（4）无TNM分期。1．2 文献检索策略：以“CYFRA21-1”、“非小细胞肺癌”主题词联合检索1990—2009年MEDLINE、EMbase、中国生物医学文献数据库、中国生物医学期刊文献数据库、中国学术期刊全文数据库、中文科技期刊全文数据库，手工检索部分相关杂志，并从相关文章的参考文献中查找可能符合纳入标准的文献。1．3 文献筛选和资料提取 按预先制定的纳入、排除标准筛选文献，提取各研究的发表信息、纳人观察对象的人口学资料、疾病基本情况、检测方法、检测数据，并用四格表描述。1．4 文献的质量评价：文献的质量分级主要参照诊断试验质量评价标准[2]，由两名评价者独立评价，若评价不一致者，经讨论决定。结合具体情况如下：（1）是否设立“金标准”或参考标准；（2）是否与金标准或参考标准进行独立的对比；（3）该资料的对比分析是否采用盲法；（4）是否连续纳入研究对象，是否包括临床实践中将使用该诊断试验的各种病人；（5）是否用正确的方法确定临界值；（6）是否提供可供计算灵敏度、特异度、似然比的数据；（7）诊断试验是否具有可重复性；（8）对退出研究的病例是否做出解释。按此标准，将研究的质量分为5个等级：A级，符合所有质量标准；B级，符合前4条标准，其他标准不完全符合；C级，符合前3条标准，其他标准不完全符合；D级，符合前2条标准，其他标准不完全符合；E级，前2条任一条不符合。1．5 数据统计分析：异质性检验：运用Meta -Disc 软件进行异质性分析。诊断性试验中异质性是由阈值效应和非阈值效应引起的，本试验通过计算灵敏度对数与( 1-特异度) 对数的spearman 相关系数检验其阈值效应，通过计算DOR(diagnostic odds ratio)的Cochran-Q值检验非阈值效应。若P>0.05则无统计学异质性，选用固定效应模式。若P<0.05则存在统计学异质性，选用随机效应模型。利用Meta –Disc软件[3,4]计算各研究的合并灵敏度（SEN）、合并特异度（SPE）、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)、诊断优势(DOR)及其95%可信区间(confidence interval, CI)，并进行综合接受者工作特征(SROC)曲线分析, 估计SROC曲线下面积(area under curve, AUC)。2 结果2．1 纳入研究的基本特征：共检出相关文献231篇，经阅读文题和摘要，初筛出39个研究基本符合纳入标准，最终纳人6个研究，其中中文4篇[5-8]，英文2篇[9,10]，共计398名研究对象，其中经金标准诊断的NSCLCⅠ—Ⅲa期140例，良性肺部疾病（benign lung diseases,BLD）258例。各研究基本特征见表1。2．2 纳入研究的质量评价：所有研究均以病理诊断作为金标准，并与病理诊断进行独立对比。研究对照组为良性肺部疾病患者。1例[6]未写明实验结果的判读临界值。所有文献均未提及结果的观察采用盲法及研究对象具有连续性。具体评价结果见表1。 表1 纳入研究特点编号作者时间研究设计盲法连续性病例数阈值 (ng/ml)TPFPTNFN1许佩舜1996诊断试验否否483.3823442熊 英2001诊断试验否否47未知1022873夏 怡2003诊断试验否否503.35228154段惠洁2009诊断试验否否853.317054145Bréchot JM1997诊断试验否否513.33122256Nisman B1998诊断试验否否1173.311481212．3 Meta分析结果：灵敏度对数与( 1-特异度) 对数的spearman 相关系数为0.232，P=0.658，表明尚不能认为存在阈值效应。DOR的Cochran-Q值为5.95，P=0.311，提示尚不能认为存在非阈值效应。因此认为纳入文献具有齐性，选用固定效应模型分析。见图1。6个研究汇总敏感度为35%（24%-44%），汇总特异度为96%（92%-98%），见图2。汇总阳性预测值为7.52（4.07-13.90），汇总阴性预测值为0.66（0.49-0.89），见图3。SROC曲线如图4，AUC为0.9441。注：图中红色圆点表示各独立研究，贯穿圆点的直线为95%可信区间，箭头区域表示数据未显示区域。圆点越大，直线分布越窄，说明该研究的样本量越大，精度越大，在汇总时给予权重越大；反之，则该研究精度越小，权重也越小。红色菱形点为汇总后值。 图1 CYFRA21-1对NSCLC早期诊断比值比的森林图注：图中红色圆点表示各独立研究，贯穿圆点的直线为95%可信区间。圆点越大，直线分布越窄，说明该研究的样本量越大，精度越大，在汇总时给予权重越大；反之，则该研究精度越小，权重也越小。红色菱形点为汇总后值。 图2 CYFRA21-1对NSCLC早期诊断敏感度和特异度的森林图注：PLR说明诊断试验正确判断为阳性的概率是错误判断为阳性的概率的倍数。比值比越大，该阳性为真阳性的概率越大。NLR越小，说明该试验结果为真阴性的可能性越大。图3 CYFRA21-1对NSCLC早期诊断阳性似然比和阴性似然比森林图注：中间蓝线为SROC，其两侧的蓝线为95%可信区间。图中红点为6个纳入研究。圆点越大，说明该研究的样本量越大，精度越大，在汇总时给予的权重越大；反之，该研究精度越小，给予的权重越小。 图4 CYFRA21-1对NSCLC早期诊断价值的受试者工作特征曲线3 讨论 由于一般肺癌的早期常无症状，经影像学等检查证明患肺癌时，往往肿瘤已扩散，失去了早期手术治疗的机会,因此寻找特异性好，灵敏度高的血清肿瘤标志物是临床急待解决的课题之一。CYFRA 21-1是非小细胞肺癌最具有价值的血清肿瘤标志物[11]。对于NSCLC，Ⅰ、Ⅱ期手术为主要治疗方法，Ⅲa期手术切除率约为20-30%，因此，本研究纳入Ⅰ—Ⅲa期NSCLC患者。 本系统评价的结果显示：CYFRA21-1对NSCLC早期诊断的汇总灵敏度为35%（27%-44%），说明其漏诊率较高，为65%。汇总特异度为96%（92%-98%），说明其误诊率低，为4%。似然比属于同时反映灵敏度和特异度的复合指标，当PLR大于10且NLR小于0.1时，具有令人信服的诊断效力，当PLR大于5且NLR小于0.2时，具有较强的诊断效能，本研究汇总PLR为7.52（4.07-13.90），提示通过检测早期NSCLC患者血清中CYFRA21-1，其结果为阳性的机会是BLD的7.52倍。汇总NLR为0.66（0.49-0.89），提示CYFRA21-1检测NSCLC错误判断阴性的机会是正确判断的66%，说明CYFRA21-1有诊断价值，但漏诊率较高。SROC曲线分析法不随阈值变化的影响，通过计算曲线下的面积及Q*值大小进一步显示了诊断试验准确度的高低，AUC=0.94， Q*=0.88，均较接近1，说明其诊断效能较高。 在我们纳入的所有文献中CYFRA21-1检测NSCLC的敏感度和特异度有明显的差异，敏感度11%-67%，特异度93%-100%，其原因可能为：人群(如疾病严重程度和伴发疾病)不同、试验条件(如不同的技术、化验、操作者)不同 ；对照组患者差异较大；试剂盒不同；确定阈值的方法不同等。 本系统评价因获得的文献较少，无法进行定量综合评价，有待今后的研究者按照诊断试验研究的要求，对CYFRA21-1检测NSCLC的早期诊断价值作进一步的前瞻性研究。本系统评价的结果来自于纳入研究，由于纳入文献仅限中、英文文献，存在纳入文献偏倚；纳入的文献未采用盲法，存在测量偏倚；数据库中，阳性结果的文献被发表，而阴性结果的文献往往不被发表，或不被发表于级别较高的杂志，因此纳入的研究中往往阴性结论的较少，存在发表偏倚；文献中对照组中良性肺部疾病包括肺结核、肺炎等，虽根据临床标准可以确诊，但无病理诊断，因此存在文献部分证实偏倚和不同证实偏倚；多数文献中对NSCLC患者未进行TNM分期，不能对NSCLC的早期诊断进行多中心荟萃分析。因此本研究结果并不能推广到每一个实验室。今后的研究应：① 尽量采用诊断试验报告标准(STARD声明)，提高诊断性试验的报告质量；②应详细描述金标准试验的操作过程及是否做到盲法；③ 应明确规定研究对象的选择标准，详细描述试验的方法及质量控制。 综上所述，CYFRA21-1对早期NSCLC阳性值表明患病的高度可能性，误诊率仅为4%，适用于对NSCLC的早期确诊，但不适用于筛查，疑似病例阴性者漏诊率高达65%，假阴性率较高，因此，对于临床疑诊为早期NSCLC而CYFRA21-1为阴性时，不能排除诊断。SROC下曲线面积为0.94，表明其诊断效能较高。为了明确CYFRA21-1对NSCLC的早期诊断价值，为其临床应用提供更加科学客观的参考依据，还需多中心合作，积累足够的病例样本量并将疾病分层，设立多组对照，采纳统一的检测方法与严格的室间质控等措施，以减少偏倚，保证研究质量，得出可信性高、指导意义强的研究结果，更准确的评价CYFRA21-1对NSCLC的早期诊断价值。参考文献1. Takei Y,Minato K,Tsuchiya S,et al.CYFRA21-1: An indicator of survival and therapeutic effect in lung cancer.Oncology,1997,54(1):43-472. 王吉耀.循证医学与临床实践,北京:科学出版社,2006:14-223. 张天嵩,钟文昭.Meta-Disc软件在诊断试验Meta分析中的应用.循证医学,2008,8（2）:97-1084. 刘关键,吴泰相.诊断性试验的Meta分析-SROC曲线法介绍.中国循证医学杂志,2003,3(1):41-445. 许佩舜.CYFRA21-1对肺癌的诊断价值.肿瘤,1996,16(2):123-1246. 熊英,范仲元,宋晓玉.原发性肺癌几种肿瘤标志物的临床应用价值.中国煤炭工业医学杂志,2001,4(9):721-7227. 夏怡,赵百亲,应可净. 血清CYFRA2 1-1、CEA检测对非小细胞肺癌的临床意义.浙江医学,2003,25(3):189-1908. 段惠洁,黄相增.血清肿瘤标志物CYFRA21-1在非小细胞肺癌的临床应用价值. 新疆医科大学学报,2009,32(2):165-1689. Bréchot JM,Chevret S,Nataf J,et al.Diagnostic and prognostic value of CYFRA 21-1 compared with other tumour markers in patients with non-small cell lung cancer:a prospective study of 116 patients.Eur J Cancer,1997:33,385-39110. Nisman B,Lafair J,Heching N,et al.Evaluation of tissue polypeptide specific antigen,CYFRA 21-1,and carcinoembryonic antigen in nonsmall cell lung carcinoma:does the combined use of cytokeratin markers give any additional information?.Cancer,1998,82:1850-185911. Maeda ,Segawa Y,Takigawa N,et al.Clinical usefulness of serum cytokeratin 19 fragment as a tumor marker for lung cancer.Intern Med,1996,35(3):764

卜丽娜 杨拴盈 尚文丽 霍树芬 张薇 刘延峰 林玉蓉 郑华东 章琳西安交通大学医学院第二附属医院呼吸科，西安， 710004通讯作者：杨拴盈 yangshuanying66@163.com, Tel:13991392919【摘要】 目的 研究肺腺癌患者组织差异蛋白，为筛选肺癌肿瘤标记提供科学依据。 方法 对6例肺腺癌及其配对正常肺组织行激光捕获显微切割(laser capture microdissection, LCM)；弱阳离子磁珠(magnetic beads based weak cation exchange, MB- WCX)分离纯化捕获的细胞；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry, MALDI- TOF–MS)技术进行分析鉴定；应用径向基函数（radial basic function, RBF）神经网络算法筛选最佳的判别模式。 结果 LCM捕获肺腺癌2.895×106个细胞，配对正常肺组织1.584×106个细胞，同质性大于95％；比较肺腺癌及其配对正常肺组织差异蛋白表达谱，在质荷比(M/Z）800～10 000范围内，肺腺癌组筛选出221个蛋白峰，正常对照组筛选出239个蛋白峰，按PTTA从小到大排序，选取差异最显著的2个蛋白峰（M/Z为7521.5和5079.3）进行分析，结果显示2种蛋白在肺腺癌组多肽图谱中的相对丰度均大部分小于正常对照组；这2种蛋白的平均值标准差比较在腺癌组的均值峰度小于正常对照组。以7521.5Da（X轴）和5079.3Da （Y轴）建立坐标系得出样品分布图：肺腺癌组与正常对照组样品分布重叠区域较少，说明这两个蛋白的分组能力良好。应用RBF神经网络算法获得一个M/Z为3358.1、5079.3和7521.5组成的判别模型，其区分肺腺癌组与正常对照组的特异性及敏感性均为100%。 结论 应用LCM联合液体芯片-质谱技术筛选出肺腺癌差异表达蛋白并建立判别模型；该技术有可能成为肺癌筛查和早期诊断的强有力工具。【关键词】肺腺癌；激光捕获显微切割；磁珠；芯片分析技术；质谱分析法；肿瘤标记Study of differential proteins in lung adenocarcinoma by using laser capture microdissection unite liquid chip-mass spectrometry technology.BU Li-na, YANG Shuan-ying, SHANG Wen-li, HUO Shu-fen, ZHANG Wei, LIU Yan-feng, LIU Yu-rong, ZHENG Hua-dong, ZHANG Lin. Department of Respiratory Medicine, Second Affiliated Hospital of Medical School, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, ChinaCorresponding author: YANG Shuan-ying, Department of Respiratory Medicine, Second Affiliated Hospital of Medical School, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China, Email: yangshuanying66@163.com【Abstract】 Objective The aim of this study is to screen lung cancer biomarker by researching the different protein in tissues of lung adenocarcinoma(AD). Methods Using laser capture microdissection (LCM) and magnetic beads based weak cation exchange (MB-WCX) to separate and purify the homogeneous AD cells and normal cells from six cases of fresh AD and matched normal lung tissues.The protein was analyzed and identified by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry(MALDI-OF-MS). Using radial basic function (RBF）neural network algorithm to screen the best pattern. Results About 2.895×106 AD cells and 1.584×106 normal lung cells were satisfactorily obtained by LCM from six cases of fresh lung AD and matched normal lung tissues. The homogeneities of cell population were estimated to be over 95% as determined by microscopic visuatlization.Comparing the differential expression proteins between lung AD and matched normal lung group's, 221 differential protein peaks [mass-to-charge ration (M/Z) between 800 and10 000] were found in lung AD group and 239 differential protein peaks were found in matched normal lung group. According to PTTA, the expression of protein peaks at 7521.5 M/Z and 5079.3 M/Z had the largest difference between them. They were significantly weakly expressed in lung AD compared to matched normal lung group's and their mean value-standard deviations were smaller than the latter. The two protein peaks could accurately separate lung AD from matched normal lung group by the frame of axes. A discriminatory pattern consisting of three proteins at 3358.1 M/Z, 5079.3 M/Z, and 7521.5 M/Z was established by radial direction primary function neural network algorithm with a sensitivity of 100% and a specificity of 100% in separating lung AD from matched normal lung group. Conclusions Differential proteins in lung AD were screened by using laser capture microdissection unite liquid chip-mass spectrometry technology,biomarker model was established at the same time. This technology has the possibility to become the powerful tool on screen and early diagnose lung cancer. 【Key Words】 Lung adenocarcinoma; Laser capture microdissection; Magnetic beadsMicrochip analytical procedures; Mass spectrometry; Biomarker腺癌是肺癌中常见的组织学类型之一。近些年，腺癌在肺癌中所占的比例有不断上升的趋势[1]；在女性肺癌患者中，腺癌的发病率已高达68%。但是，肺癌总体生存率并不高，迄今为止，尚缺乏有效的、尤其是具有早期诊断价值的方法[2]。液体芯片-质谱技术是蛋白质组学研究的新策略，是筛选肿瘤差异表达蛋白质、寻求新的标志物的有力工具。本研究初步探讨该技术在肺腺癌患者组织差异蛋白研究中的应用，为筛选质肿瘤标记提供依据。对象与方法一、研究对象收集2006年6月至2008年6月西安交通大学医学院第二附属医院临床资料完整、术前未行放疗及化疗、经手术切除、病理证实的6例肺腺癌患者癌组织及配对的远癌正常肺组织（距癌组织5cm以上）。6例患者女4例，男2例，年龄在45~69岁，中位年龄58岁。国际抗癌联盟TNM分期：ⅡA期1例，ⅡB期2例，ⅢA期1例，ⅢB期2例。二、主要试剂及仪器尿素(Urea)、EDTA、CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、 MB- WCX、α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）购自德国Bruker Daltonics公司；Bradford试剂盒购自北京赛驰生物科技有限公司；HM500冰冻切片机(美国Microm公司)；Pixcell显微激 光切割系统及细胞收集器（LCM cap）（美国Arcturus公司）；AutoflexⅡ质谱仪（美国ThermoFisher公司）；负压储血管、移液器、聚丙烯Eppendorf 3810型微量离心管（EP管）及枪头购于西安润德生物技术有限公司。三、方法1．标本采集：标本在手术室内采集。在组织离体20min内，手术刀切取肿瘤组织及其正常肺组织（距癌旁5cm以外或最远处）；用4℃冰盐水冲洗3-5次，将血液冲净；用无菌剪刀将肺组织剪成1×1×1.5cm3大小的组织块，再用无菌生理盐水反复冲洗；分装于标志清楚的1ml离心管（标记姓名、日期、住院号）内，放液氮罐内速冻，转置-80℃冰箱保存备用。整个标本采集过程控制于30min内。2．冰冻切片及染色：-28℃冰冻切片机内切成8μm厚冰冻切片并染色。染色具体步骤为[3]：苏木精1s，蒸馏水冲洗10s，伊红10s，85％乙醇10s，95％乙醇10s，无水乙醇Ⅰ10s，无水乙醇Ⅱ10s，二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ2min。上述染色过程在冰盒中进行，染液温度控制于4-10℃之间，总时间不超过6 min。3．LCM：染色后的切片自然风干后，放置于Pixcell显微激光切割系统内行LCM。设定激光捕获条件：Duration 15.5ms、Current 8.0mA、Sample Thickness 8.0um、Laser Spot Size 7.5um、Pulse Power 80 mW、Pulse Width 25.0ms、Threshold Voltage 60mV。每张冰冻切片平均5000 shots，LCM时间不超过30分钟。捕获结束后LCM caps -80℃储存备用。4．蛋白提取及定量：LCM caps内加入裂解液（9.5M Urea，65mM DTT，4%CHAPS，0.2% IPGbuffer，裂解液和酶抑制剂以体积比50：1混合）冰浴。用1ml微量加样器将上述混悬液移入离心管中；超声破碎细胞（80w，5次，每次10秒，间隔15秒，冰上完成）。离心15 000g，45分钟，取上清，按Bradford试剂盒说明操作，测得肺腺癌组样品平均蛋白含量为0.7mg/ml，配对正常组样品平均蛋白含量为0.6mg/ml，60ug分装，－80℃保存。5．磁珠分离纯化：取出4 ℃冷藏储存的MB- WCX悬浮液，混匀1 min。取10 l 磁珠、10 l磷酸盐缓冲液加入200 l样品管中，再加入30ug待测蛋白，混匀，室温静置5 min。将样品管置入磁珠分离器贴壁1 min；去除悬浮液体，避免吸走磁珠；加入100 l 磁珠清洗缓冲液；在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次；样品管在磁珠分离器上静置，磁珠贴壁从磁珠分离器上取下样品管，吸去悬浮的液体；向样品管中加入5l磁珠洗脱缓冲液，溶解贴壁的磁珠。样品管置入磁珠分离器，磁珠贴壁2 min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入干净的0.5 ml样品管，加入5l磁珠稳定缓冲液，小心吸打混匀，收集在0.5 ml样品管中，质谱分析备用。6．点样：新鲜配制HCCA、0.3 g/L及2/1色谱级乙醇/丙酮。样品管置于冰盒中预冷。磁珠洗脱缓冲液在准备质谱靶点样前拿出，并置入磁珠分离器数秒，用加样枪反复吸打至少5次后，取1μL与基质10 l完全混合后，取1μL混悬液点靶，室温干燥后上机检测。7．MALDI-TOF-MS检测：实验质控：实验中每8个样品数据采集前先做外标校正，作为外标校正的标准品含有11个肽，平均分子量偏差肺癌早期诊断方法，是目前提高肺癌根治率，降低病死率的主要途径。随着后基因组时代的到来，蛋白质组学技术成为目前肿瘤研究中最有效的方法学之一[5]。在蛋白质预处理方法中，应用较广的双相凝胶电泳（2-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）因其费时费力，重复性较差，极大的限制了它的实际临床应用价值。凝胶内差异电泳（difference in-gel electrophoresis, DIGE）技术是在2-DE技术基础之上发展起来定量分析凝胶内蛋白质点的新方法，比传统2-DE技术有着更高的敏感性、特异性、重复性和高通量的特点；但DIGE需要Cy2、Cy3、Cy5等荧光标记物，过程复杂而且费用昂贵，因此尚难大规模推广应用[6-7]。新兴的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技术，具有上样量小，操作简单，灵敏度高等特点，但其重复性一直是较多学者争议的问题[8-9]。诞生于20世纪90年代末的LCM技术，能在目视下精确的从标本中特异性的分离出目标细胞，可以成功的去除细胞异质性对实验结果产生的干扰，很好的解决了肺癌研究中肿瘤异质性的问题[10]。但通过该方法获取的细胞数较小，往往难以满足传统双向电泳对上样量，重复性的需要[11]。液体芯片-质谱技术是蛋白质组学研究的新策略，是筛选肿瘤差异表达蛋白质、寻求新的标志物的有力工具。该技术上样量小，在检测时具有很高的重复性，可一次性检测出2000多种不同的蛋白或多肽，可以对潜在的肿瘤标志物直接进行鉴定。近年来应用该技术已在直肠癌、膀胱癌、甲状腺癌及肺癌等疾病的早期诊断中取得了一些很有意义的研究结果[12-15]。在儿童急性淋巴细胞白血病的研究中，Pitts R等[16]应用液体芯片质谱技术筛选到四个有望成为急性淋巴细胞白血病生物标志物的差异蛋白峰（M/Z分别为2437.7、6457.9、7772.2、9420.5）。目前在德国，该项技术平台已用于儿童急性淋巴细胞白血病的早期辅助诊断。在本实验中，我们收集了6例肺腺癌及其配对正常肺组织，应用LCM技术捕获肺腺癌肿瘤细胞及其配对正常肺组织支气管肺泡上皮细胞，其同质性高达95%，有效克服肺癌组织研究时的异质性问题，降低了癌变组织蛋白质组学研究的背景干扰，使实验结果更真实有效。应用MB- WCX分离纯化捕获的细胞。在实际应用中，该方法操作简单，只需要几次简单的混匀、冲洗和洗脱过程即可完成样品的预处理，具有较好的临床应用前景。使用的MB- WCX常用于检测组织和血清标本，MB- WCX的活性加样点上含有弱型阴离子羟基，能与表面带正电荷如赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）及组氨酸（His）等蛋白质结合，可用于高PI蛋白质的选择性分析和生物标记分子的检测。经MALDI-TOF-MS质谱分析后，在M/Z 800～10 000范围内，肺腺癌组筛选出221个蛋白峰，正常组筛选出239个蛋白峰；对差异最显著的两个蛋白（M/Z为7521.5和5079.3）进行分析，这2种蛋白在肺腺癌组多肽图谱中的相对丰度均大部分小于正常对照组。以7521.5Da（X轴）和5079.3Da （Y轴）建立坐标系，得出样品分布图，肺腺癌组与正常组样品分布重叠区域较少，说明这两个蛋白的分组能力良好。我们应用RBF神经网络算法，获得一个由M/Z分别为3358.1，5079.3，7521.5组成的判别模型，经盲法交叉测试结果显示：6例肺腺癌及其配对正常肺组织全部预测正确，敏感度和特异度均达100%；这三种蛋白有可能是肺癌潜在的肿瘤标志物。我们拟进一步扩大样本量，尝试其他种类的芯片或者多种芯片组合筛选差异蛋白并进行验证，明确筛选出的这些候选蛋白的生物学特性。综上所述，本研究首次应用LCM联合液体芯片-质谱技术研究肺腺癌及其配对正常肺组织差异表达蛋白质并建立判别模型。该技术有可能成为肺癌筛查和早期诊断的强有力工具。参 考 文 献[1] Crocetti E, Paci E. 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尚文丽1 张和平2 杨拴盈1 张薇1 霍树芬1 刘延峰1 郑华东3 章琳3 杜洁11西安交通大学医学院第二附属医院呼吸科 西安 710004 2陕西省宝鸡市中心医院呼吸内科3西安交通大学医学院第二附属医院老年呼吸科通讯作者:杨拴盈 【摘要】目的：应用Meta分析法综合评价低剂量螺旋CT（low-dose spiral computed tomography）在肺癌筛查中的价值。方法：在PubMed、Cochrane等数据库检索1996年-2010年期间的相关文献资料；根据纳入标准筛选符合条件的文献；对文献进行信息统计、科学性评估及质量分级；采用随机效应模型进行数据分析；通过似然比（likelihood ratio, LR），加权灵敏度和特异度（Pooled Sensitivity and Specificity）及汇总受试者工作特征曲线 （summary receiver operator characteristic curve，SROC曲线）等统计指标综合评价LDCT在肺癌筛查中的价值。结果：共纳入12篇英文文献，由9个独立研究构成，研究对象28024例。文献质量评估结果提示纳入文献质量较好；LDCT在肺癌筛查中价值的合并+LR为3.35，-LR为0.29，加权灵敏度为0.735（0.730～0.740），特异度为0.791（0.747～0.830），SROC曲线下面积（Area under curve, AUC）为0.8473。结论：多数独立研究单位报道的LDCT在早期肺癌筛查中的价值评价一致。通过汇总相关研究结果显示，LDCT在早期肺癌筛查中具有较高的价值，但仍需要高质量的随机对照研究以更准确地评价其临床价值。关键词：低剂量螺旋CT，早期肺癌，meta分析，筛查Role of low-dose spiral CT scan in lung cancer screening: a Meta-analysis 【Abstract】 Objective: Using meta analysis to evaluate the value of LDCT in screening for lung cancer. Methods: Searching the relevant documentation from PubMed, ISI Web of Knowledge ,Cochrane and other databases from 1996 to 2010; screening eligible literature according to the inclusive criteria; literatures were gathered as statistical information, assessed the quality of scientific and classified; using random effect model to analyze data; to evaluate the value of LDCT in screening for lung cancer comprehensively by the likelihood ratio (LR), the pooled sensitivity, specificity and summary receiver operating characteristic curve (SROC curve) statistical indicators. Results: 12 English literatures were collected，with 9 independent researches and a total of 28024 cases were brought into the study. Heterogeneity test showed that the homogeneity of the study was good, which showed the quality of literature collected in this study was preferable; the value of the + LR was 3.35,-LR was0.29, the weighted sensitivity of 0.735（0.730～0.740）, the specificity was0.791（0.747～0.830） and SROC area under the curve (Area under curve, AUC) to0.8473 by using LDCT screening lung cancer. Conclusion: The reports of the most independent research on the LDCT screening for lung cancer were simply consistent. Using LDCT to screen for lung cancer had a high value through the summary of relevant research results, but it still needed high-quality random control trail to assess its value in clinic more accurately.Key words: LDCT，early lung cancer，Meta Analysis，screening肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，这主要是由于肺癌早期症状轻微，大部分病人在就诊时已属中晚期，因而造成了大量的术后转移和复发[1]。临床研究表明:早期肺癌患者综合治疗后,5 年生存率可达60 %～90 %。故提高肺癌患者生存率的关键在于早发现、早诊断、早治疗。大规模临床试验表明，胸部X线片加痰细胞学检查作为肺癌普查手段不能降低肺癌的死亡率[2-4]。低剂量螺旋CT（LDCT）成为近年来早期肺癌筛查研究的热点。然而，独立单位的研究往往存在一定程度的偏倚，为了对LDCT在早期肺癌筛查中的价值作出科学的评价，本文应用Meta分析法对其进行循证医学研究。一、材料与方法1．资料来源：从PubMed、Cochrane、Web of science、Medline、Springerlink、CNKI、万方等数据库检索发表年限为1996年1月至2010年2月的中英文文献。检索词主要包括：早期肺癌、筛查、低剂量CT、low-dose spiral computed tomography、early lung cancer or lung tumor、screening。对检索到的重要文献的参考文献进行二次检索。2．纳入标准：（1）各文献采用的研究主题及方法基本一致。（2）中文文献的发表期刊为核心期刊。（3）文献研究对象不是来自某一特定人群，且样本量>30例。（4）以病理学结果作为金标准，对无病理学结果者，需以随访1年以上而做出的临床诊断为标准。（5）文献能直接或间接的提供计算灵敏度、特异度、比值比(odds ratio, OR)等指标的数据。（6）具有详细的成像方法及质量保证的描述。（7）设计良好的前瞻性研究或回顾性研究, 随访严密 ,随访年限≥1年。（8）排除肺外恶性肿瘤的诊断。（9）明确诊断前未行干预治疗。3．排除标准：（1）排除述评、综述、文摘及案例报道等文献材料。（2）分组混乱；不能提取间接相关数据；根据描述提取的间接数据计算所得灵敏度、特异度与文献所给不一致者。（3）临床资料描述不详细；无病理对照或以临床诊断为标准而随访不足1年者。（4）研究主题不符。 4．文献的科学性及质量评价：文献的科学性[5]主要包括以下四个方面：（1）该试验是否与金标准试验进行了独立、盲法比较。（2）是否每个被检测者都经参照试验进行评价。（3）所研究患者样本的一致性。（4） 诊断试验的精确性。文献质量分级主要参照循证医学指南中的“证据分级水平及依据”，分为5个等级：A级：设计良好的随机对照试验；B级：设计较好的队列或病例对照研究；C级：病例报告或有缺点的临床试验；D 级：个人的临床试验；E级：没有足够的证据以形成一种意见。5．敏感性分析：将纳入研究逐一排除后，对剩余研究进行meta分析，评价汇总灵敏度与特异度。结果变化不大，说明纳入文献的稳定性好；反之，入文献的稳定性差。6．数据统计方法：（1）获取统计量：以LDCT首次筛查出的肺部非钙化结节中金标准判断为阳性者记录为真阳性（TP）;LDCT首次筛查出的肺部非钙化结节中金标准判断为阴性者记录为假阳性（FP）;随访1年为止经金标准判断为阳性但LDCT判断为阴性者记录为假阴性（FN）;随访1年为止经金标准判断为阴性且LDCT判断为阴性者记录为真阴性（TN），建立诊断试验四格表。用统计软件获得其诊断比值比（the diagnostic odds ratio, DOR）及其95%可信区间（95%CI）。对同一指标的多个不同试验进行 Meta 分析，根据OR值的权重，用受试者工作特征曲线表示，这条曲线称为汇总受试者工作特征曲线（summary receiver operator characteristic curve，SROC曲线）。为防止ROC曲线产生可察觉的偏倚而进行Cox校正，进而对DOR值行Logist转化，建立拟合直线方程，制作SROC曲线。（2）异质性检验：Meta 分析所用的统计方法根据纳入研究是否具有齐性分为确定性模型统计方法和随机模型统计方法。而文献纳入的异质性[6]主要是由阈值效应和非阈值效应引起，本研究通过计算灵敏度对数和（1-特异度）对数的Spearman相关系数检验其阈值效应；通过DOR的Cochran-Q值来检验非阈值效应。若拒绝同质性假设，则选择随机效应模型，反之，则选择确定性模型。7．统计学处理：Meta-Disc1.4软件进行统计学分析并作图。二、结果1. 检索结果：初步检索英文文献110篇，中文文献43篇。经阅读摘要并排除重复文献、文摘、综述及个案等进一步筛选，然后详细阅读全文，用纳入及排除标准进行衡量，对检索到的重要文献的参考文献进行二次检索，最终共纳入文献12篇，均为英文文献。分别由9个独立研究机构完成，9篇均为前瞻性研究。纳入文献的详细信息见表1. 表1纳入文献的详细信息 作者研究中心样本量（人）年龄（岁）吸烟史（包年） 是否高危人群质量评分（级）Ugo Pastorino等[7] 意大利1035≥50≥20是BTakeshi Nawa等[8]日本795650~69不要求是BShusuke Sone等[9]日本548340~74不要求 否AClaudia I.Hensch等[10-11]美国1000≥60≥10是BStefan Diederich等[12-13]德国817 >40≥20是BGiulia Veronesia等[14]意大利5201≥50≥20是BS. J. Swensen等[15]美国1520≥50≥20是BJohn K. Gohagan等[16]美国166050~74≥20是ARavi J. Menezes等[17]加拿大3352≥50≥10是B2. 文献评价结果：评估表明本研究所纳入的文献具有科学性，质量评价为A级或B级，进行敏感性分析后表明纳入文献稳定性较好，且样本量大，具有一定的代表性，可用于Meta分析。 3. 数据分析：共入选文献12篇，纳入研究对象28024人，年龄在40岁以上。（1） 异质性检验：本组研究结果显示灵敏度对数和（1-特异度）对数的Spearman相关系数=0.417，P=0.265，P >0.05，表明不存在阈值效应，如表2所示。计算DOR值的Cochran-Q=30.9，df=8，P=0.0001，P <0.05，表明存在非阈值效应。如图1。以上结果表明纳入文献存在异质性，考虑与纳入文献的人群、年龄等有关，故应采用随机模型进行meta分析。表2：Analysis of Diagnostic Threshold Spearman correlation coefficient: 0.417 p-value= 0.265(Logit(TPR) vs Logit(FPR)------------------------------------------------------------------------------- Moses' model (D = a + bS)Weighted regression (Inverse Variance) Var Coeff. Std. Error T p-value--------------------------------------------------------------------------------a 2.532 0.291 8.703 0.0001b( 1) -0.076 0.179 0.425 0.6836--------------------------------------------------------------------------------Tau-squared estimate = 0.5357 (Convergence is achieved after 8 iterations) Restricted Maximum Likelihood estimation (REML) No. studies = 9 图1为诊断比值比的森林图，红点表示具体数值，横线表示95%CI，箭头表示数据未显示区域。（2） 加权灵敏度和特异度：因为文献所提供的资料具有异质性，所以采用随机效应模型。用DerSimonian-Laird统计方法计算合并DOR值、灵敏度和特异度，并计算其95%CI，作森林图。DORDL=12.37（7.17-21.35）（见图1）。汇总加权灵敏度和特异度经过样本的间接合并，得合并灵敏度=0.735（0.730～0.740），特异度=0.791（0.747～0.830）（见表3）。图2、3、为其森林图，可以直观的看到各文献对于合并灵敏度与特异度的加权的大小。汇总加权的阳性似然比（+LR）=3.35、阴性似然比（-LR）=0.29，如图4、5所示。表3：Summary Specificity and SensitivityStudy | Spe [95% Conf. Iterval.] Sen [95% Conf. Iterval.] --------------------------------------------------------------------------------------Ugo Pastorino | 0.820 0.795 - 0.844 0.773 0.546-0.922Takeshi Nawa | 0.739 0.730 - 0.749 0.975 0.868-0.999Shusuke Sone | 0.953 0.947 - 0.958 0.458 0.314-0.608 Claudia I. Henschke | 0.787 0.760 - 0.812 0.794 0.621-0.913 Stefan Diederich | 0.580 0.545 - 0.615 0.692 0.482-0.857Giulia Veronesia | 0.476 0.463 - 0.490 0.859 0.770-0.923 S J. SWENSEN | 0.492 0.466 - 0.517 0.880 0.688-0.975John K. Gohagan | 0.812 0.792 - 0.830 0.750 0.588-0.873Ravi J. Menezes | 0.834 0.821 - 0.847 0.862 0.753-0.935 -------------------------------------------------------------------------------------- Pooled | 0.735 0.730 - 0.740 0.791 0.747-0.830--------------------------------------------------------------------------------------Heterogeneity chi-squared = 45.72 (d.f.= 8) p = 0.000Inconsistency (I-square) = 82.5 图2、3为LDCT在早期肺癌筛查中的灵敏度和特异度的森林图，图4、5 为其阳性似然比和阴性似然比的森林图。图中红色圆点(·)表示该研究指标的数值，贯穿其的直线为相应的95% CI。最后一个菱形红点为合并后的数值。若圆点越小，直线分布越宽，说明该研究的精确度小，在加权时给予的权重小；反之，则该研究的精确度大，权重也大。（3） 应用metadisc软件制作SROC曲线：表2显示直线相关b=-0.076，与0差异无统计学意义，故提示SROC曲线是对称的，故选择Symmetric和Weighted least Squars进行曲线制作限制，如图6所示为纳入文献的拟合SROC曲线及其95%CI，AUC=0.8473。图6 SROC曲线图6为9项纳入研究的汇总ROC曲线，即SROC曲线。坐标 X轴为1 - 特异性 ；Y轴为敏感性。图中红点表示各纳入研究的实际值，若圆点越小，加权时给予的权重小；反之，则权重大。图中中间一条蓝线表示本组研究所求得的SROC曲线，其两侧的两条蓝线为其95%CI。三、讨论：肺癌是目前发病率和死亡率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤，因此有效的早期肺癌的筛查方法是全世界亟待解决的问题。目前研究用于肺癌筛查的主要方法有影像学、痰细胞学检查以及新近发展起来的分子病理学、纤维支气管镜及荧光纤支镜等检查。早在20世纪70、80年代，美国、日本的医学中心已有用胸部X线片和痰脱落细胞学作为肺癌筛查方法的多中心、大样本、随机对照研究，但是各研究机构的结果表明：胸部X线片虽然可以检出一些肺癌, 但对微小病灶及隐蔽病灶不敏感，痰脱落细胞学仅对起源于大气道的中心型肺癌有较高的敏感性，经临床积极治疗后,肺癌患者的5年存活率并没有改善,且最终未能降低总体死亡率，因此它们并没有推荐胸片及痰脱落细胞学作为早期肺癌筛查的手段[2,18-22]。胸部CT扫描是目前公认的显示胸部病变最敏感的影像学检查方法,但若以常规剂量完成全肺采集 ,特别是薄层扫描,人体将吸收相当大剂量的X线辐射,对设备的负荷也过大。因此,降低曝光剂量又不影响影像质量的 LDCT成为当前研究的热点。由于肺本身为含气组织 ,肺泡内空气与周围软组织的对比度高,多个研究表明LDCT并未降低其对肺部结节的检出能力 [23-25]。Meta分析是一种强有力的科学研究方法,它实际上是以更高、更宏观的视野把所有相关研究综合起来进行探索性地分析,寻求其内在的规律。80年代关meta分析的研究报告开始增多并逐渐应用到临床医学的各个领域。本研究用meta分析方法将各研究中心关于LDCT筛查早期肺癌的研究综合分析，文章质量评价显示文献均为A级或B级，且各研究样本量大，可信度较高，但荟萃分析时DOR值的Cochran-Q=30.9，df=8，P=0.0001，提示各研究结果间存在非阈值效应，考虑异质性原因有：1.纳入文献均为英文文献，存在一定的语言偏倚及发表偏倚；2.各研究机构所选用的设备（如普通CT机、单层和多层螺旋CT机）及扫描参数（扫描持续时间，扫描层厚、管电压、管电流）不统一；3.研究对象的年龄、性别、人种构成，吸烟指数不统一；3.阅片者不同，对影像结果的判断不同。故本文采用MetaDisc1.4软件中的随机效应模型进行结果分析示：LDCT在早期肺癌筛查中的汇总灵敏度为0.735，波动于0.46~0.98，特异度为0.791，波动于0.48~0.95，两者波动幅度均较大，这不仅与上述产生异质性的原因有关，同时与病灶所在的部位、病灶密度的高低、病灶的大小、病变时间长短（早期病变不易检出）及研究对象本身的特性有关，并且本研究仅分析LDCT在首次筛查中的敏感性和特异性。汇总加权的阳性似然比（+LR）=3.35、阴性似然比（-LR）=0.29。LR是同时反映灵敏度和特异度的复合指标。其不受患病率的影响，全面反映诊断试验的价值。+LR说明诊断试验正确判断为阳性的概率是错误判断为阳性概率的倍数。比值越大，该阳性是为真阳性的概率越大。-LR值越小，说明试验结果为真阴性的可能性越大。故+LR越大，-LR越小，诊断试验的诊断价值越高。有研究表明当+LR大于10且-LR小于0.1时，具有令人信服的诊断效力，当+LR大于5且-LR小于0.2时，具有较强的诊断效能[26]，评价诊断试验价值的另一指标是SROC曲线及其AUC。SROC曲线不受阈值变化的影响，通过图形和面积直接对诊断性试验进行比较，其更准确的反映敏感度和特异度之间的线性关系，AUC代表诊断试验的准确性，本研究所得 SROC曲线下面积为0.8473，提示LDCT在早期肺癌筛查中有较高的诊断价值。目前LDCT作为肺癌筛查主要的争议有:（1）假阳性问题：有研究报道[27]，小于5mm的肺部结节中，恶性比例约为3%，而大于10mm的结节中恶性的比例高达50%左右。LDCT虽然能发现更多的肺癌，但同时良性结节的检出率也随之增加。假阳性可能导致患者产生医源性焦虑、额外的侵袭性检查和增加费用；（2）能否最终提高肺癌患者的5年生存率问题：存在领先时间偏倚，这种偏倚是指筛查诊断的时间和临床诊断的时间之差,被解释为因筛查延长的生存时间,这种表面上延长的生存时间，实际上是筛查导致诊断时间提前所致的误差,即早期诊断没有使死亡时间延后，只是诊断时间提前使得从诊断时算起的5年生存率提高,而并没有真正改变死亡率。总之，目前研究的结果表明LDCT可以筛查出更多的肺癌，特别是早期肺癌，故LDCT是目前来说作为肺癌筛查最有效的手段。但是仍需开展更多的大样本、多中心、随机、对照试验以掌握更全面的信息,包括筛查人群的纳入标准(吸烟史、年龄组)和筛查时间间隔 ,以及明确LDCT筛查能否降低肺癌患者死亡率。参考文献：[1] Gazdar AF, Minna JD. 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张薇1,杨拴盈1,霍树芬1,尚文丽1,杜洁1,林秀丽1,卜丽娜2,明宗娟1,张德信1,南岩东1,田应选1,林玉蓉1,刘延峰1通讯作者:杨拴盈1.西安交通大学医学院第二附属医院呼吸科，2.西安市第二医院呼吸科，西安 710004摘要 目的 评价ELISA法检测血清胃泌素释放前体肽(Pro-Gastrin-releasing Peptide, Pro-GRP)诊断小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)的价值。方法 检索PubMed、Cochrane、ISI Web of Knowledge等数据库，检索时间为1990—2009年发表的相关文献，收集关于酶联免疫吸附法( Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测血清Pro-GRP诊断SCLC的相关研究文献并进行信息统计、科学性评估及质量分级；采用Meta-Disc1.4软件进行数据分析；通过汇总敏感度、特异度、汇总似然比及汇总受试者工作特征曲线（SROC曲线）等统计指标综合评价ELISA法检测血清Pro-GRP对SCLC的早期诊断价值。结果 共纳入11片文献，其中英文6片，中文5片，样本量为3554例，其中经病理学确诊的SCLC为1122例，NSCLC为2432例。异质性检验显示纳入研究齐性好，通过确定模型的汇总计算得出汇总敏感度为0.75（0.73，0.78），汇总特异度为0.93（0.92，0.94），汇总阳性似然比11.44，汇总阴性似然比0.27，SROC曲线下面积为0.93。结论 有限的证据表明：Pro-GRP在早期诊断SCLC中有一定的参考价值，可作为较重要的参考指标之一，但需要更多高质量、大样本、多中心的研究加以验证。关键词 胃泌素释放前体肽；肿瘤标志物；SCLC；ELISA法；Meta分析Diagnostic Value of Serum Pro-Gastrin-releasing Peptide (Pro-GRP) in Small Cell Lung Cancer Patients: A Systematic ReviewYang Weilin2, Zhang Wei1, Yang Shuanying1, Huo Shufen1, Shang Wenli1, Du Jie1, LinXiuli1, Bu Lina3, Ming zongjuan1, Zhang Dexin1, Nan Yandong1, Tian Yingxuan1, Lin Yurong1, Liu Yanfeng11. Department of Respiratory Medicine, Second Hospital of Xi,an Jiaotong University, Xi,an 7100042. Department of Geriatric Respiratory Medicine, Second Hospital of Xi,an Jiaotong University, Xi,an 7100043. Department of Respiratory Medicine, Second Hospital of Xi,an, Xi,an 710004Abstract Objective To evaluate the diagnostic value of serum pro-gastrin-releasing peptide (Pro-GRP) in patients with small cell lung cancer (SCLC). Methods We searched PubMed、Cochrane、ISI Web of Knowledge and other databases (1990-2009) to collect studies which evaluated the diagnostic value of Pro-GRP in patients with SCLC. The statistical information and quality of science were assessed and classified. The data were analyzed using Meta-Disc1.4 software. The diagnostic value of Pro-GRP in SCLC was evaluated by the pooled sensitivity, specificity, the likelihood ratio (LR) and summary receiver operating characteristic curve (SROC curve) statistical indicators. Results Eleven literatures were collected including 6 in English and 6 in Chinese, and 3554 cases were included in the study (1122 SCLC and 2432 Non-SCLC patients，all diagnosed by pathologic diagnosis), Heterogeneity test showed that the homogeneity of the study was good. By using deterministic models to analyze the data, the value of the weighted sensitivity was 0.75, the specificity was 0.93, the positive likelihood ratio was 11.44, negative likelihood ratio was 0.27, and the SROC area under the curve (AUC) was 0.93.Conclusion Pro-GRP could be regarded as one of the valuable reference tests in patients with SCLC, but more high quality lager sized, prospective studies are required to assess its clinical value more accurately.Key words Pro-Gastrin-releasing Peptide, Tumor marker, Small cell lung cancer, ELISA, Meta-analysis肺癌是迄今全球最常见的恶性肿瘤之一，其中小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)占肺癌的15%-20%，且近年有增高的趋势[1]。SCLC是一种病因复杂、分化程度低、预后极差的恶性肿瘤。以往神经元特异性烯醇酶（Neuron Specific Enolase, NSE）用于SCLC的诊断，但其敏感度较低，尤其在局限期（limited disease，LD) SCLC中的敏感性更低，故并不是SCLC早期诊断的理想肿瘤标志物[2]。胃泌素释放肽(Gastrin-releasing Peptide，GRP)具有促进胃泌素释放的作用，最早从猪的胃组织中分离出来[3]，是由27个氨基酸组成的肠脑肽。但由于GRP活性部分在血清中不稳定，从血清中提取可靠的GRP比较困难，因而不能用于临床检测。胃泌素释放前体肽(Pro-GRP)是GRP的前体结构，普遍存在于非胃窦组织、神经纤维、脑和肺组织的神经内分泌细胞内，在血清中稳定存在。研究报道Pro-GRP 31-98是最敏感的SCLC肿瘤标志物，其可用ELISA法检测[4-5]。近年来对Pro-GRP在SCLC诊断中的作用进行了大量研究，并与NSE进行对比，对其在早期诊断SCLC中的价值作出了不同程度的肯定，然而独立研究的样本量较少，有一定的局限性。因此，为了正确、科学的评价应用ELISA法检测Pro-GRP在SCLC诊断中的价值，我们收集公开发表的相关文献进行系统评价。1 资料与方法1.1 资料来源：从PubMed、Cochrane、ISI Web of Knowledge、Springerlink等英文数据库及中国知识资源总库、万方数据库、中文数据库检索1990年1月-2009年12月公开发表的相关文献。英文检索词为small cell lung cancer、Pro-GRP、ELISA。中文检索词为小细胞肺癌（SCLC）、胃泌素释放前体肽、酶联免疫吸附法。为避免漏查，采用手工检索及网上检索结合的方法，并对检索到的文献中的参考文献进行补充检索。1.2 纳入与排除标准 1.2.1 纳入标准：（1）研究类型为诊断性研究。（2）研究主题为Pro-GRP对SCLC的诊断价值。（3）研究对象包括SCLC、NSCLC及易误诊为的肺癌的肺部良性病变，SCLC的诊断金标准为病理学诊断，对照组中排除肾功能衰竭患者。（4）原始资料完整可提取四格表。（5）语言限于中文和英文。（6）检测方法为ELISA法。（6）有具体的Pro-GRP测定值。1.2.2 排除标准：（1）文摘、讲座、述评及综述类文献。（2）对照组包括正常人群。（3） 应用RSA(Radioimmunoassay)进行检测。（4）样本量小于30。(5)SCLC患者非初始治疗患者。（6）SCLC患者全部或部分未经病理证实。1.3 文献的质量评价：文献的质量分级主要参照诊断试验质量评价标准[6]，由两名评价者独立评价，若评价不一致者，经讨论决定。结合具体情况如下：（1）是否设立“金标准”或参考标准；（2）是否与金标准或参考标准进行独立的对比；（3）该资料的对比分析是否采用盲法；（4）是否连续纳入研究对象，是否包括临床实践中将使用该诊断试验的各种病人；（5）是否用正确的方法确定临界值；（6）是否提供可供计算灵敏度、特异度、似然比的数据；（7）诊断试验是否具有可重复性；（8）对退出研究的病例是否做出解释。按此标准，将研究的质量分为5个等级：A级，符合所有质量标准；B级，符合前4条标准，其他标准不完全符合；C级，符合前3条标准，其他标准不完全符合；D级，符合前2条标准，其他标准不完全符合；E级，前2条任一条不符合。1.4 数据提取：提取研究作者、研究中心、年龄、性别比例、发表时间、原始四格表数据、试剂盒来源、金标准、研究类型及连续性，临界值。1.5 数据统计分析：1.异质性检验：运用Meta -Disc 软件进行异质性分析。诊断性试验中异质性是由阈值效应和非阈值效应引起的[7]，本试验通过计算灵敏度对数与( 1-特异度) 对数的spearman 相关系数检验其阈值效应，通过计算DOR(diagnostic odds ratio)的Cochran-Q值检验非阈值效应。若P>0.05则无统计学异质性，选用固定效应模式。若P<0.05则存在统计学异质性，选用随机效应模型。2. 利用Meta –Disc软件[8]计算各研究的合并灵敏度（SEN）、合并特异度（SPE）、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)、诊断优势(DOR)及其95%可信区间(confidence interval, CI)，并进行综合接受者工作特征(SROC)曲线分析, 估计SROC曲线下面积(area under curve, AUC)。2.结果2.1 纳入研究基本特征：最初检索到英文文献250篇，中文文献128篇。发表时间为1990年1月—2008年12月，符合纳入标准的共13篇，排除一篇应用RAS测定[9]，一篇应用电化学发光法测定[10]后最终纳入11篇文献，其中英文文献6篇[11-16]，中文文献5篇[17-21],共计3554名研究对象，其中经金标准诊断的SCLC1122例，NSCLC 2070例，362例非恶性肺部疾病。各研究基本特征见表12.2 纳入研究的质量评价：所有研究均以病理诊断作为金标准，并与病理诊断进行独立对比。5篇研究对照组为NSCLC，其余6篇研究对照组为NSCLC和非恶性肺部疾病患者。11篇文献明确描述待评价试验的实验步骤、操作方法等, 使他人易在相同条件下重复；所有文献均写明实验结果的判读临界值。但有些条目还欠缺：大多数文献未说明金标准与检测试验之间的时间间隔是否够短，是否病情已发生变化；仅3篇文献提及结果的观察采用盲法；3篇文献提及研究对象具有连续性。具体评价结果见表1表1 纳入文献的详细信息编号作者研究中心发表时间研究设计盲法连续性质量评估1TakujiNational Cancer Center Hospital1997-01诊断试验否否D2KoichiNational Cancer Center Hospital East,Kashiwa,Chiba,Japan1997-09诊断试验是否C3TakuoOkayama Univercity Medical School2000-08诊断试验否是D4TakadaOsaka Prefectural Habikino Hospital1995-12诊断试验是是C5PierreCentre Regional de Lutte contre le Cancer et Centre de Recherche2000-01诊断试验是否C6NoriakiNational Nishi-Gunma Hospital1999-11诊断试验否是D7武静山西肿瘤医院2009-10诊断试验否否D8余秉翔解放军总医院呼吸科2003-03诊断试验否否D9杨拴盈西安交通大学第二附属医院2005-06诊断试验否否D10金欣军事医学科学院附属医院2006-08诊断试验否否D11杨谨西安医科大学第一附属医院2000-05诊断试验否否D2.3纳入文献的基本数据，见表2： 表2 纳入文献的诊断试验参数信息编号作者病例数阈值 (Pg/ml)TPFPTNFNSen(%)Spe(%)Acc(%)1Takuji1214631770137091832Koichi7504614023521666896883Takuo359497412233406595864Takada32633.87322203287290855Pierre20553117257298097856Noriaki1274636574127594877武静12214522782869438491908余秉翔1364644378118096909杨拴盈14446469721773898210金欣9046341441176988711杨谨75402214487398882.4 Meta分析结果：灵敏度对数与( 1-特异度) 对数的spearman 相关系数为-0.310，P=0.354，表明尚不能认为存在阈值效应。DOR的Cochran-Q值为14.64，P=0.146，提示尚不能认为存在非阈值效应。因此认为纳入文献具有齐性，选用固定效应模型分析。见图1。11个研究汇总敏感度为75%（73%-78%），汇总特异度为93%（92%-94%），见图2。汇总阳性预测值为11.44（9.73-13.44），汇总阴性预测值为0.27（0.23-0.32），见图3。SROC曲线如图4，AUC为0.934。注：图中红色圆点表示各独立研究，贯穿圆点的直线为95%可信区间，箭头区域表示数据未显示区域。圆点越大，直线分布越窄，说明该研究的样本量越大，精度越大，在汇总时给予权重越大；反之，则该研究精度越小，权重也越小。红色菱形点为汇总后值。 图1 Pro-GRP对SCLC诊断比值比的森林图注：图中红色圆点表示各独立研究，贯穿圆点的直线为95%可信区间。圆点越大，直线分布越窄，说明该研究的样本量越大，精度越大，在汇总时给予权重越大；反之，则该研究精度越小，权重也越小。红色菱形点为汇总后值。 图2 Pro-GRP诊断SCLC的敏感度和特异度的森林图注：PLR说明诊断试验正确判断为阳性的概率是错误判断为阳性的概率的倍数。比值比越大，该阳性为真阳性的概率越大。NLR越小，说明该试验结果为真阴性的可能性越大。图3 Pro-GRP诊断SCLC的阳性似然比和阴性似然比森林图注：中间蓝线为SROC，其两侧的蓝线为95%可信区间。图中红点为11个纳入研究。圆点越大，说该研究的样本量越大，精度越大，在汇总时给予的权重越大；反之，该研究精度越小，给予的权重越小。图4 Pro-GRP诊断SCLC价值的受试者工作特征曲线3. 讨论 本研究结果显示Pro-GRP诊断SCLC的汇总灵敏度为75%（73%-78%）,说明其漏诊率较高，为25%。汇总特异度为93%（92%-94%），提示其误诊率为7%。似然比属于同时反映灵敏度和特异度的复合指标，当PLR大于10且NLR小于0.1时，具有令人信服的诊断效力，当PLR大于5且NLR小于0.2时，具有较强的诊断效能[22]，本研究汇总PLR为11.44（9.73-13.44），提示通过ELISA检测SCLC患者血清中Pro-GRP，其结果为阳性的机会是NSCLC的11.44倍。汇总NLR为0.27（0.23-0.32）提示Pro-GRP检测SCLC错误判断阴性的机会是正确判断的27%，说明Pro-GRP有较高的诊断价值。SROC曲线分析法不随阈值变化的影响，通过计算曲线下的面积及Q*值大小进一步显示了诊断试验准确度的高低，AUC=0.93 Q*=0.87，均较接近1，说明Pro-GRP诊断SCLC的准确度较高。以往常用的诊断SCLC肿瘤标志物为NSE。研究[23]报道：关于Pro-GRP检测SCLC的敏感度明显高于NSE（65%vs43%），局限期患者检测Pro-GRP的敏感度也明显高于NSE（65%vs46%）。国内研究[24]也显示：NSE诊断SCLC价值的系统评价的合并敏感度是0.67，95%CI（0.64，0.71），合并特异度是0.91，95%CI（0.90，0.92）均低于Pro-GRP，提示Pro-GRP较NSE对SCLC有更高的敏感度及特异度，可作为诊断SCLC的重要肿瘤标志物。在我们纳入的所有文献中Pro-GRP检测SCLC的敏感度和特异度有明显的差异，敏感度63%-84%，特异度70%-99%，其原因可能为：不同的研究中心所选用的试剂盒不同（可能是包被的抗原不同）；不同的研究中心确定阈值的方法不同。Takada等[14]以健康人群的95%可信区间确定阈值，Pieere等[15]以Yoden指数法确定阈值，其余研究均采用试剂盒所提供的参考值。不同研究所选用的对照组患者差异较大，仅以NSCLC为对照组的研究可能造成合并特异度降低。病例组局限期/广泛期组成不同，也可造成差异，广泛期比例越高，可能造成其合并敏感度升高。使用相同试剂盒的研究其敏感度和特异度也有明显差异，在使用日本先端生命株式会社试剂盒的4个研究中，敏感性最高84%[17]，最低73%[19]，特异度最高98%[20]，最低89%[19]，Takuji等[11]和Takuo等[13]均使用了Tonen Corp提供的试剂盒，但其敏感度分别为70%和65%，特异度分别为91%和95%，说明各实验室的检测准确性亦有一定差异，从而造成其平均漏诊率过高，SROC曲线下面积较小，制约了ELISA法检测Pro-GRP的诊断价值。本研究尚存在如下不足：（1）纳入的文献多数未采用盲法，存在测量偏倚。（2）数据库中，阳性结果的文献被发表，而阴性结果的文献往往不被发表，或不被发表于级别较高的杂志，因此纳入的研究中往往阴性结论的较少，存在发表偏倚[25]。（3）纳入文献语种为中文和英文，可能存在语种偏倚。（4）文献中对照组中良性肺部疾病包括肺结核、肺部炎症等，虽根据临床标准可以确诊，但无病理诊断，因此存在文献部分证实偏倚和不同证实偏倚。（5）多数文献中对SCLC患者未进行TNM分期，不能对SCLC的早期诊断进行荟萃分析。综上所述，Pro-GRP对SCLC诊断特异度为93%，说明其误诊率仅为7%，适用于对SCLC的诊断。但其敏感度为75%，假阴性率较高，不适用于筛查。SROC下曲线面积为0.93，表明Pro-GRP对SCLC有较高的诊断价值，且其较NSE有更高的灵敏度与特异度。但由于本研究纳入文献大多数未采用盲法，且大多数文献中纳入病例收集无连续性，因此纳入文献的质量较低，今后仍需更多大样本，多中心，双盲试验，以便Pro-GRP更准确的评价诊断价值。参考文献：[1]Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. 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杨拴盈（西安交通大学医学院第二附属医院呼吸科 西安 710004）杨拴盈（1966-），男（汉族），教授，主任医师，医学博士，博士研究生导师。研究方向：肺癌的基础和临床研究。E-mail: yangshuanying66@163.com Mobile 13991392919摘要：肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。早期诊断是改善其预后的关键。由于肺癌在临床和病理学方面均表现出明显的异质性，故缺乏理想的早期诊断措施。本文介绍了肺癌早期诊断的现状、进展和存在的问题，探讨了今后研究的方向。关键词：肺癌；早期诊断；影像学诊断；痰脱落细胞学检测；支气管镜；生物标志物Current status, confusion, and prospect of early diagnosis in lung cancerYang Shuanying (Department of Respiratory Medicine, Second Hospital of Xi,an Jiaotong University, Xi,an 710004)E-mail: yangshuanying66@163.com Mobile 13991392919Abstract: Lung cancer is a malignant tumor with the highest morbidity and mortality currently. Early diagnosis is the key to improving the prognosis of Lung cancer. Because lung cancer shows significant heterogeneity at the clinical and pathological aspects, so we have no good measures of early diagnosis. This article describes the status, progress and problems of early diagnosis in lung cancer, and explores the direction for future research.Key Words: Lung Cancer, Early Diagnosis , Imaging Diagnosis; Sputum Cytology, Bronchoscopy,Biomarker肺癌目前是全球范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。近20年来，由于大力推行戒烟，欧洲和美国等西方国家男性肺癌的发病率已开始下降，但女性肺癌的发病率却持续上升。我国是香烟生产和销售大国，不论男性还是女性，肺癌的发病率均呈持续上升趋势，尤以女性发病率上升更快。临床研究表明，原位癌治愈率接近100%，Ⅰ期肺癌患者的5年生存率达60%~90%，而Ⅲb和Ⅳ患者的5年生存率仅5%~20%。提示早期诊断是改善肺癌预后的关键。然而，由于缺乏理想的早期诊断方法，肺癌的早期诊断率仅14%左右。因此，如何提高肺癌早期诊断水平已成为肺癌防治工作者的严肃而紧迫的任务。肺癌高发区的研究证实从接触致癌因素到形成临床癌（鳞状细胞癌）约需30年[1]；肺癌发病率和死亡率的模式与吸烟的时间模式一致，其间有20余年的潜伏期[2]。由此说明，肺癌是可以预防和早期诊断、早期治疗的疾病，问题是我们临床医师如何在这漫长的过程中发现肺癌？肺癌的临床表现复杂多样。大多数患者早期往往无明显的症状和体征，部分患者可出现咳嗽、痰中带血、胸和肩部疼痛、发热、食欲下降、局限性喘鸣等，但这些表现常被患者甚至专业医师所忽略。因此，要早期发现肺癌，首先，必须大力加强肺癌科普知识宣传，提倡对高危人群（40岁以上的男性、重度吸烟者、有肿瘤家族史者、有职业暴露史者及慢性肺疾病患者等）进行定期（每半年一次）筛查。其次，呼吸科医师必须具有强烈的责任心和扎实的理论知识，仔细采集病史，全面、认真查体，保持对肺癌的高度警惕；要密切关注相关学科的发展动态，及时汲取新知识。只有这样，才能充分掌握并科学运用相关检查方法，减少漏诊和误诊，提高肺癌早期诊断水平。1．影像学检查方法 X线胸片仍是肺癌筛查最常用、最基本的方法。对肺癌病例的回顾性分析发现[3]，90%的肺癌在早期的X线胸片上已有异常改变。造成漏诊和误诊的原因是：病灶隐藏在心脏后、肺尖区、肺门旁、肋骨及膈肌附近等隐蔽区；读片不慎；已有明确病变存在而遗漏了新病变。近年来，应用计算机辅助检测系统（computer-aided detection, CAD），通过对比增强观察模式、结节增强观察模式及自动或手动的分割模式对数字化胸部影像中的肺部结节进行显示、辨认、标记及定量分析，明显提高了重叠及隐蔽区病灶的发现率。螺旋CT（spiral CT, SCT）是肺癌影像学诊断中的一个里程碑式的进步。其可发现直径＜5mm的病灶；对Ⅰ期肺癌的发现率达71%~100%。对无症状的患者，单次CT筛查可较X线胸片早1年发现病变。目前认为，CT扫描最关键技术是切薄层，做增强，测数据，用软件。增强CT扫描可显示结节及其边缘的微小血管结构，对判断结节的良恶性有重要价值。在SCT的基础上，加用靶向高分辨CT（high resolution CT, HRCT）或局部靶重建，可进一步显示病灶内部结构、边缘特征及其与肺门、胸膜的关系。低放射剂量SCT（low dose SCT, LDSCT）是迄今最佳的肺癌筛查方法。在不降低图像质量的同时，其辐射剂量仅为常规剂量的1/6，对肺内小结节的检出率是X线胸片的10倍。应用LDSCT技术，国际早期肺癌行动计划（International early lung cancer action project, I-ELCAP）[4]对31567例40岁以上的高危人群进行了筛查，发现484例肺癌，其中344例属Ⅰ期，10年生存率为80%。对其中302例患者在诊断后1月内进行了手术治疗，其10年生存率达92%。然而，另一项大规模研究[5]发现，Ⅰ期肺癌的生存率与I-ELCAP结果相似，但在第二年后，Ⅰ期肺癌的比例明显减少，可能与年度筛查容易发现那些早期、生长缓慢的病变，难以发现那些生长快、早期即有转移的肺癌有关。虽然LDSCT能发现早期肺癌，但筛查组肺癌死亡率和对照组肺癌死亡率无显著性差异[5-6]。提示LDSCT能否作为肺癌筛查的常规方法仍有争议。由美国国家癌症研究所于2002年启动、50000余人参与的、目前正在进行随访的国家癌症筛查试验（national lung screen trial, NLST）结果值得期待。当然，LDSCT在早期肺癌筛查中存在领先时间偏倚（lead time bias。存活时间不受影响，早诊断出来只是早知道而已）、病程偏倚（length time bias，有的肺癌生长缓慢，呈良性过程，即使未检查出来亦能长期存活）和过度诊断偏倚（overdiagnosis bias）[7]。LDSCT难以确定非钙化结节的性质，导致4%~55%的患者过度治疗[8]。磨玻璃影（ground glass opacity, GGO）是多种疾病如炎症(包括非特异性炎症、结核及曲霉感染)、局灶性纤维化、非典型腺瘤样增生（atypical adenomatous hyperplasia, AAH，为腺癌癌前病变）、小腺癌及细支气管肺泡癌较为常见的影像学表现。其在CT上呈局灶性云雾状影，病变区血管及支气管影清晰可见，CT值约－300Hu。持续存在的GGO，尤其是结节状GGO可能是早期肺腺癌或AAH的征象。由于LDSCT产生的噪音较重，与GGO相似，故不宜用于GGO的诊断[9]。对于GGO，应进行薄层扫描（层厚1.0~1.5mm），管电压应在200~400mA[9]。正电子发射体层显像(positron emission tomography，PET）是一种新的分子影像学技术，是迄今获得肿瘤代谢信息的最敏感的方法，是目前判断肺部病灶良恶性最可靠的无创检查方法。PET-CT是将PET和CT安装于同一机架，对PET提供的代谢信息和CT提供的高分辨解剖信息进行准确匹配、融合，不仅能显示病灶和周围组织结构的关系，而且可准确定位示踪剂异常浓集的部位。研究发现[10]，PET-CT诊断肺癌的敏感性、特异性及准确性均可达85%左右。孤立性肺结节（solitary pulmonary nodule, SPN）的定性诊断一直是困扰临床医师的难题。PET-CT诊断SPN的敏感性达96%，但特异性并不理想（40%~80%）。其原因可能与阅片者的主观性及PET/CT的局限性有关[11]。值得一提的是，PET-CT诊断SPN的阴性预测值很高（92%~96%），表明该检查阴性的病变往往为良性，可不进行活检，定期随访即可。尽管大量临床研究提示PET/CT对肿瘤的诊断和鉴别诊断有重要作用，但其多为单中心的回顾性分析，缺乏大样本、多中心的前瞻性研究[11]；炎性假瘤、活动性肺结核、曲霉病、肉芽肿等可造成假阳性，假阳性率达10%；腺癌、细支气管肺泡癌及类癌可见假阴性；PET/CT在图像采集过程中受呼吸运动影响，导致肺癌的较为有效的方法。该法无创，操作简单，可系统的、动态的观察上皮细胞从不典型增生到癌前病变直至浸润癌的连续渐变过程。PETTY[13]发现，用该法诊断的肺癌中14%为原位癌，74%为Ⅰ期肺癌。痰检诊断中央型肺癌的敏感性约50%，而对周围型肺癌则不足20%。由于阳性率不高，故国内目前对该法明显重视不够。阳性率不高的原因可能主要与留痰的方法不规范、送检次数少（肺癌的诊断提供了一种新的工具。晚近，一种基于Feulgen thionin染色DNA的自动核影像分析技术不但提高了检测早期肺癌的敏感性，而且还具有较高的特异性[15]。检测痰标本中P16、脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad gene, FHIT）等基因启动子超甲基化、P53和K-ras基因突变、HYAL2 和 FHIT基因（烟草致癌的靶点）缺失及不均一核糖核蛋白A2/B1过度表达、微卫星改变及自身抗体在早期肺癌的诊断中均可能有一定价值[16-18]。3．支气管镜检技术支气管镜检技术的开展为肺癌的诊断带来了革命性的变化。传统的白光支气管镜(white light bronchoscopy, WLB)主要适用于中央型肺癌(诊断率达90%~93%)，对于周围型肺癌，尤其是对癌前病变的诊断率很低（的预防和早期诊断提供了基础。现已明确，鳞状发育不良是鳞癌的癌前病变；AAH及弥漫性、特发性肺神经内分泌细胞增生分别是腺癌和类癌的癌前病变；肺纤维化可能是一种癌前病变；小细胞肺癌的癌前病变目前还不清楚。P53、FHIT、C-erbB-2、表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)、表面活性物质脱辅蛋白A、β连环素等可能是癌前病变的标志物。由于难发现、难取材，故关于癌前病变的研究甚少。自荧光支气管镜（autofluorescence bronchoscopy, AFB）技术是近十年来癌前病变诊断方面最主要的进展。其利用组织自荧光的不同特性观察支气管黏膜病变。在波长为442nm的蓝光激发组织时，正常支气管黏膜呈绿色荧光，癌前病变呈棕色，肿瘤组织呈红色。在AFB指引下，可对异常荧光区域进行活检。该法对高危人群、反复痰血或痰检发现异型细胞者及隐性肺癌患者有重要意义；在癌前病变、原位癌及微小侵袭癌的诊断方面，AFB的敏感性较WLB高1.2~6.2倍，但特异性仅4%~94%，低于WLB。联合应用SCT、痰检和AFB可显著提高癌前病变及原位癌的诊断率[19]。由于AFB主要适用于中央型肺癌，对周围型肺癌意义不大；假阳性率过高；仪器价格昂贵，故不宜作为肺癌筛查的常规工具。支气管内超声技术（endobronchial ultrasound, EBUS）自从1992年应用于临床以来，随着EBUS仪器性能日臻完善，操作技术日渐成熟，已建立了气道及纵隔的超声声像图谱，使支气管镜的检查范围从管腔内扩展到了管腔外，明显提高了支气管镜的检查效率，已成为胸部肿瘤诊断和治疗中最有前景的微创技术之一[20]。根据超声探头的不同，EBUS分为径向探头（radial probe, RP）-EBUS和凸面探头（convex probe, CP）-EBUS。RP-EBUS系早期开发，探头直径2mm，可清楚显示气道壁及其周围组织的细微结构，可显示深达5cm的肺门及纵隔淋巴结，主要用于检查周围型（亚段以下支气管）病灶。对SPN，EBUS引导下的经支气管肺活检（transbronchial biopsy，TBB）的敏感性和准确性分别为75%和83%；当病灶＞3cm时，常规TBB和EBUS-TBB的敏感性和准确性无显著差异。但该探头不能进行实时监控下病灶活检。CP-EBUS为近年开发，探头和镜体远端融合，顶端外径6.9mm，可测量病灶的平面大小；有多普勒模式，可观察病灶的血供及其周围的血管情况；可进行实时监控下的病灶活检，明显提高了穿刺的准确性和安全性。主要用于大气道壁及其周围病灶的观察和活检。CP-EBUS引导下经支气管针吸活检（transbronchial needle aspiratory，TBNA）判断肺癌淋巴结转移的敏感性、特异性及阴性预测值分别为94%、100%及96%，明显优于CT及PET，尤其当淋巴结＜10 mm时；EBUS联合内镜超声（endoscopic ultrasonography，EUS）实时引导几乎可对所有纵隔淋巴结进行活检，有可能取代纵隔镜成为纵隔淋巴结分期的新的“金标准”。因此，该技术是近20年来肺癌分期方面最主要的进展之一。但CP-EBUS价格及维修费用昂贵，难以普及。迄今关于EBUS对周围型肺癌诊断价值的研究尚少，且多为回顾性或小样本，严格意义上的前瞻性、随机、对照、多中心研究尚未见报道；EBUS对癌前病变诊断的价值的尚不明确。尽管如此，EBUS操作简单，安全性好，在肺癌淋巴结分期、SPN及周围型病灶的诊断方面仍具有明显的优势。电磁导航支气管镜（electromagnetic navigation bronchoscopy, ENB）具有仿真支气管镜和可曲式支气管镜的特点。该仪器由电磁定位板、定位传感探头、工作通道、计算机软件系统与监视器（将CT图像进行虚拟仿真三维支气管重建）组成。该技术主要适用于传统支气管镜或肺穿刺无法确诊的周围型病灶。它既可以准确到达常规支气管镜无法到达的肺部周围型病灶，又可进行活检，安全性高。但该仪器昂贵，操作复杂，需进行培训（包括认读CT仿真支气管镜图像及掌握气道内解剖知识等）。2000年已有应用ENB进行周围型病灶检查的报道[21]。目前，在美国和欧洲进行了为数不多的小样本临床研究，发现ENB成功率为67%~88%，中叶最高；成功率与病灶大小无关；平均检查时间16~45min。由于相关研究尚少，故其对周围型肺癌的诊断价值尚需进一步积累资料。荧光共聚焦显微镜（fluoresecent confocal microscope, FCFM）检查是将直径1mm的纤维光学探头装入支气管镜工作通道，从而获得活组织显微图像。其具有实时观测；对可疑病变部位有选择的进行检查，即“光学活检”，极大的提高了活检阳性率，并避免了在阴性部位活检和重复操作；探测范围深达支气管壁下50μm；光源和探测器整合在一个微型探头，经工作通道达肺泡管，故亦称肺泡镜；图像放大倍数和分辨率使肺泡结构及其内细胞清晰可见；实时视频。但FCFM检查范围小；需先行AFB。THIBERVILLE等[22]应用FCFM准确诊断了22例支气管上皮化生，19例间变，5例原位癌和2例浸润癌。联合应用FCFM和AFB，可在最小的组织损伤下，观察和癌前病变有关的基底膜变化，甚至原位癌。该检查目前仍处于实验阶段，准确性尚待进一步研究。4． 生物标志物（谱）生物标志物的筛选一直是肿瘤早期诊断研究的热点。迄今，文献报道的肿瘤标志物已超过1200余种，但美国食品药品管理局批准用于临床的不足10种。癌胚抗原（carcinoembryomic antigen, CEA）、细胞角蛋白19的片断（cytokeratin 19 fragments, CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）、糖链抗原（carbohydrate antigen, CA）125、CA199、鳞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen, SCCAg）等是目前常用的标志物，但这些标志物对肺癌的筛查和早期诊断几乎没有价值。分子生物学研究显示，检测血液循环中的肿瘤细胞、DNA、杂和性丢失（loss of heterozygosity, LOH）、微卫星不稳定性、端粒酶催化亚单位活性、K-ras及P53突变、FHIT基因缺失、P16超甲基化等均可能对肺癌早期诊断有一定价值[23, 24]。但由于肺癌是一种多因素诱导、多基因参与、多阶段发展的复杂疾病实体；肺癌组织具有明显的异质性。因此，单一标志物对肺癌，尤其是早期肺癌的诊断价值非常有限。近十余年来，随着高通量、大规模基因及蛋白质分析技术的涌现，肿瘤基因组学、蛋白质组学、代谢组学等研究方兴未艾，已筛选出了许多有前景的候选标志物谱（profiles）[23-28]。XIAO等[25]建立了一个新的策略来发掘肿瘤细胞释放到血液中的游离蛋白，将CD98、fascin、多聚免疫球蛋白受体分泌片断和14-3-3 eta联合检测，其诊断肺癌的敏感性和特异性分别为95.56%和76.92%。应用表面加强激光解吸离子化飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）技术，YANG等[26]从208份血清（其中158份来自肺癌患者，50份来自健康人）中筛选出一个由5种肽组成的标志物谱，其诊断Ⅰ/Ⅱ期肺癌的敏感性达79%，明显优于目前临床上应用的标志物。应用激光捕获显微切割（解决肺癌组织的异质性问题）联合SELDI-TOF-MS方法，YANG等[27]对13例Ⅰ/Ⅱ期肺癌及6例良性肺疾病组织进行分析，筛选出了一个由两种肽组成的标志物谱，其诊断肺癌的敏感性、特异性和阳性预测值均为100%。呼出气含有多种易挥发的有机化合物，这些物质有可能成为肺癌早期诊断的标志物[29]。另外，慢性阻塞性肺病的气流受限已成为公认的肺癌危险因子，故带有肺量计的呼出气标志物检查有望成为肺癌早期诊断的手段。当然，上述研究的影响因素较多，其结果的重复性有待进一步验证，但其毕竟为肺癌早期诊断带来了曙光。5． 展望肺癌是一种复杂的分子网络疾病。尽管有多种方法可以发现并诊断早期肺癌，但这些方法均不理想。理想的肺癌早期诊断方法应是操作简单、安全、无创，标本易获得，敏感性和特异性高，重复性好，费用低，易于普遍推广。因此，以高危人群、癌前病变及早期肺癌患者为主要研究对象，应用高通量技术，从基因和蛋白质水平筛选血液、呼出气及痰液中肺癌筛查和早期诊断标志物谱可能是今后研究的方向。参考文献1. 孙燕。肺癌病因、诊断、治疗中的困惑和展望[J]。中国肺癌杂志，1998，1（1），1-62. 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