李宗涛医生的科普号

近年来冠心病外科治疗迅速发展和普及, 由于移植血管的内膜增生、纤维化及钙化等问题, 面临再次移植。目前血管移植材料不足或质量差不能满足临床需要, 迫切需要研发一种符合自体人工血管生理特性的人工血管材料。组织工程血管支架的构建需满足以下3 个原则: ① 有高抗张强度和机械支持特性的生物兼容性成分(胶原纤维或其他相似成分) ; ② 有生物兼容性弹力成分提供回缩力, 防止动脉瘤形成; ③ 非活化交汇处, 内皮组织防止血栓形成仍是一个挑战, 存在许多未解决的问题和障碍[128 ]。我们的实验旨在为构建一种新型小口径血管移植材料提供理论依据。1 材料与方法1. 1 主要试剂与材料人类白细胞抗原DR (human leukocyte an t igenDR, HLA 2DR ) 单克隆抗体、HLA 2ABC 单克隆抗体(福州迈新生物技术有限公司) , SP 免疫组织化学染色试剂盒(北京中山生物技术有限公司) , 弹力纤维试剂盒(广州华俊医疗器械有限公司) ,V G 染色试剂盒、胶原酶(天津灏洋生物制品科技有限公司)。全自动病理图像分析仪(CM IA S 公司, 北京) , 扫描电镜(JEOL 2SM 225S,L E ICA 公司, 德国)。由华北煤炭医学院附属医院妇产科和唐山市妇幼医院正常分娩产妇自愿捐赠的新鲜、健康胎儿脐动、静脉各60 根, 每根长10 cm , 37℃浸泡于含抗生素的灭菌液24 h。1. 2 实验分组根据不同的处理方式, 将上述标本分为正常组、冷冻组及酶原组, 每组脐动、静脉各20 根。分组时每根血管取015 cm 送细菌培养。1. 2. 1 冷冻组 将脐血管置入冷存管, 加入DM EM培养液, 4℃存放15 m in, - 20℃冷冻存放24 h,- 196℃液氮贮藏24 h 以上。取出, 37℃水浴30～ 60 s,快速复温, 无菌生理盐水灌冲血管腔数次, 去除残留血管内皮细胞。1. 2. 2 酶原组 4℃肝素生理盐水冲洗脐血管腔后,加入011% ° 型胶原酶, 止血钳夹闭两端, 37℃水浴消化5、10、15 和20 m in。取消化20m in 的脐血管样本行扫描电镜、脐血管顺应性及HLA 2ABC、HLA 2DR 抗原检测。1. 2. 3 正常组 4℃ Kerb’s 液恒温存放。1. 3 观测指标1. 3. 1 组织学观察 标本常规固定、脱水、石蜡包埋,片, 厚4 Lm, 每组标本连续切片20 张, 行HE、弹力纤维及胶原纤维染色。1. 3. 2 扫描电镜观察 各组脐血管标本经2. 5% 戊二醛固定后, 扫描电镜观察脐血管内皮细胞、平滑肌细胞及弹力纤维形成情况。1. 3. 3 脐血管顺应性检测 按照Schaner 等[9, 10 ]建立的方法检测。取各组脐血管2 cm 并标记。脐血管一端与三通管相连, 另一端与进样器相连, 确保血管不扭曲, 且三通管位置恒定, 压力换能器经过标定。实验过程中血管标本均水浴于恒温水槽Kerb’s 液中, 内通混合氧。进样器通过硬塑管与血管相连。将血管标本和压力舱充满Kerb’s 液, 排出气泡。调节位移器使血管标本保持在体长度, 通过进样器将等量Kerb’s 液以一定速率阶梯式充抽, 标本内压力通过压力换能器在BL 2420 生物技能系统中记录。进样时先循环加压和减压5 次对血管进行预处理, 再测定4 个压力循环(0、513、1017、1313 kPa ) , 作为压力2容积关系的正式数据。顺应性计算原理: 各组脐动、静脉实测压力2容积曲线显示, 在生理压力范围内曲线曲率较大, 非线性特征明显。超过生理压力范围, 线性特征逐渐明显; 压力2容积曲线近似抛物线的上升支, 可用二次抛物线函数V = ap 2+ bp + c 表示。通过拟合, 得出二次抛物线函数系数a、b、c 值及表示实测数据与二次函数拟合程度的复相关系数R。应用二次抛物线对压力2容积进行拟和时, 血管顺应性C 计算公式为: C= dv dp =2ap+ b。1. 3. 4 脐血管HLA 2ABC 及HLA 2DR 抗原检测免疫组织化学染色及V IDA S 图像处理系统处理, 半定量分析抗原表达量。以成人淋巴结做阳性对照,PBS 代替一抗做阴性对照。镜下每个样本取50 个不同面积, 测量平均吸光度(A ) 值, 代表抗原表达量, 以阴性对照的平均A 值作为本底, 每次取样均在相同条件下进行。1. 4 统计学方法采用SPSS 1115 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示, 组间比较采用方差分析, P 值< 0105为有统计学意义。2 结果2. 1 灭菌效果60 根经灭菌处理后的胎儿脐血管均无细菌生长。2. 2 组织学观察冷冻组: 脐静脉内壁上无血管内皮细胞; 中膜平滑肌细胞未见明显改变, 弹性纤维量少, 散在分布, 胶原纤维则交织成网状, 密集分布; 外膜疏松结缔组织、成纤维细胞及少量平滑肌细胞结构正常。脐动脉内皮细胞已完全去除, 显示内皮下发达的纵行平滑肌层; 平滑肌细胞未见明显改变, 弹力纤维及胶原纤维排列基本正常(图1 a)。酶原组: 胶原酶作用5 m in, 脐血管仅有少量内皮细胞脱落; 作用10 m in, 内皮细胞脱落近半, 15 m in 内皮细胞已大部分脱落, 但仍有少量残余, 20 m in 内皮细胞完全去除, 脐静脉显示面为内皮下层、胶原纤维和弹力纤维, 脐动脉露出中层平滑肌细胞(图1 b)。正常组: 脐静脉壁单层由内皮细胞、内皮下层和内弹力膜组成, 内膜较薄, 中膜较厚, 外膜显疏松结缔组织; 脐动脉壁内膜更薄, 没有内弹力膜, 中膜内弹性纤维少。2. 3 扫描电镜观察冷冻组: 脐静脉内壁上无内皮细胞, 血管内弹力膜清晰可见, 弹力膜表面结构完整、光滑而无损伤; 脐动脉内皮细胞已完全去除, 显示面为内皮下发达的纵行平滑肌层(图2 a、b)。酶原组: 胶原酶作用20 m in, 脐静脉内皮细胞已完全去除, 显示面为内皮下层以及纤细的胶原纤维和弹力纤维; 脐动脉内皮细胞已消失, 露出纵行平滑肌细胞层表面(图2 c、d)。正常组: 血管内皮细胞呈长梭形或椭圆形, 顺血管长轴呈螺旋状排列, 未见内膜下结构。2. 4 血管顺应性二次抛物线方程拟合结果见表1。各组压力与容积之间的复相关系数均> 0196, 且有统计学意义(P <0101) , 表明二次抛物线方程对各组实测数据拟合较好。从表2 可以看出, 各组脐血管顺应性均随压力上升下降, 但组间差异均无统计学意义(P > 0. 05)。相同压力下, 脐静脉的顺应性为脐动脉的2～ 3 倍。2. 5 HLA 2AC、HLA 2DR 抗原检测冷冻组、酶原组较正常组明显减少, 且差异均有统计学意义(P < 0101) ; 冷冻组与酶原组相比, 两种抗原表达量均降低, 且差异有统计学意义(P < 0101) ; 各组脐动脉表达量均大于脐静脉, 且差异有统计学意义(P < 0101)。结果见表3。3 讨论冠心病外科的发展与血管移植材料的发展密切相关, 找到理想的血管移植材料是血管移植成功的关键。李幼平等[11 ]作了大量超急性排斥反应的实验研究发现, 血管组织中仅内皮细胞有血清抗体结合反应, 平滑无此反应, 说明只要阻断血管内皮上的这些抗原抗体反应, 就不会造成血管超急性排斥反应。我们的实验采用低温法、酶原法去除脐血管内皮细胞, 并对两种方法加以比较, 为构建一种新型的小口径血管移植材料提供理论依据。3. 1 低温法脱脐血管内皮细胞我们的实验显示, 经低温冷冻处理后, 脐静脉除掉了内皮细胞而未损伤弹力膜, 脐动脉保留了平滑肌层,有利于自体血管内皮细胞种植。以深低温保存技术为基础, 复温后无菌生理盐水灌冲血管腔数次, 便可去除残留在血管内壁上的内皮细胞。原因可能是血管壁各层在热胀冷缩过程中收缩程度不同, 其中较薄的内皮容易与内皮下弹力层分离, 使用溶液冲洗内壁后将内皮细胞去掉[12, 13 ]。3. 2 酶原法脱脐血管内皮细胞我们采用011% ° 型胶原酶通过管腔内消化法观察不同消化时间对内皮细胞脱落情况, 显示消化20 m in后内皮细胞脱落比较干净, 此时脐静脉保留了内皮下层, 脐动脉保留了中膜, 有利于内皮细胞种植。酶原法脱脐静脉内皮细胞时, 比低温冷冻法多保留了内皮下层, 是否更有利于细胞种植, 有待进一步研究。3. 3 血管顺应性与移植的关系实验表明, 酶原组脐血管顺应性比正常脐血管略小; 冷冻组脐血管顺应性比正常脐血管顺应性略大, 但三者差异无统计学意义。其原因可能由于内皮细胞在正常状态下对顺应性的贡献较小, 所以除去内皮细胞血管顺应性虽然降低, 但并不明显。然而, 在超低温条件下血管内胶原纤维和弹性纤维部分交联, 从而导致血管外壁拉伸力增大, 血管顺应性增强。既往研究认为脐静脉的顺应性约为相应脐动脉的24 倍[14, 15 ]。本实验表明脐静脉顺应性是脐动脉的2～ 3倍, 间接支持脐静脉具有普通中等动脉相似结构、内弹力膜结构完整以及平滑肌较厚的结果。脐静脉的功能是把氧气和营养物质从胎盘输送给胎儿, 担负着动脉作用, 既能承载一定的应力, 有较大的扩张能力; 还富含平滑肌, 具备收缩能力。将脐静脉移植于脐动脉后,能很快适应动脉的力学环境, 提高静脉移植后的远期通畅率。3. 4 血管HLA 2ABC 和HLA 2DR 表达的变化血管组织抗原性主要存在于内皮细胞表面和中层平滑肌细胞, 其中内皮细胞抗原性最强。我们的实验结显示, HLA 2ABC 和HLA 2DR 在正常组、冷冻组及酶原组均有表达, 且动脉大于静脉; 冷冻组和酶原组血管抗原表达量较正常组显著降低, 进一步表明内皮细胞的抗原性最强; 冷冻组抗原表达量低于酶原组, 且差异有统计学意义(P < 0101)。可能由于冷冻使部分主要组织相容性抗原决定簇封闭[16 ] , 或通过改变蛋白的空间结构, 减少抗原的表达[17 ]。

1 引言血管工程学是利用组成血管壁的活细胞和相关的细胞外机制,构建血管材料的一门新兴的边缘科[ 1 ] 。实施的具体方法是:将体外获得的或经培养获得的高浓度的、功能相关的细胞种植于天然或人工合成的细胞外基质上,经过一段时间培养,再将它移植到自体内, 以修复原有器官功能。血管替代物的研究包括种子细胞、血管基质材料及血管的力学性质的研究等。近年来,随着血管外科在欧美国家的迅速发展和普及,其手术方法不断改善, 手术适应证不断扩大,急诊手术和复合手术的增加提高了手术疗效。再次手术也不断增加。对血管移植材料的需求大大增加。传统的血管移植材料主要有: ①自体血管; ②同种异体血管; ③异种异体血管; ④人工血管。由于移植的血管内膜增生、排斥, 内膜纤维化、钙化等问题,目前使用的血管移植材料其寿命也只有10 年左右,这就面临着再次移植的问题,由于血管材料的不足或其血管材料质量差不能满足临床的需要, 这就需要研究和开发出一种符合自体血管生理的血管材料以解决血管移植时其材料不足或质量差的问题。大量超急性排斥反应的基础研究发现,血管组织中只有内皮细胞有血清抗体结合的反应, 而平滑肌无此反应,这说明只要阻断血管内皮上的这些抗原和抗体反应,就不会造成血管的超急性排斥反应。因此,人们采用不同的方法去除血管内皮细胞作为血管支架,可避免超急性排斥反应的发生。2 血管移植材料2. 1 自体血管 以大隐静脉为首选, 但由于管径小,有时静脉质量差(如大隐静脉曲张、浅静脉炎等) ,或已做过大隐静脉剥离术,利用率不到50 %。2. 2 小口径人工血管移植现状 1978 年, Herrin2g[ 2 ] 首次报道使用内皮细胞种植技术(endothelial cell seeding) 对人工血管进行内皮化,从而开辟了人工血管内皮化的新途径。经过20 多年的发展,人工血管内皮化相关技术包括内皮细胞的分离、种植和人工血管材料技术等方面已取得较大进展。在血管组织工程基质材料方面, 目前生物相容性材料是研究的重点,生物相容性材料包括天然和人工合成材料,人工合成材料主要有二种, 一种为不可降解材料如聚甲基丙烯酸甲酯( Poly methyl - meth acrylate , PM2MA) 、聚四氟乙烯( Polytet raflu - oro ethylene ,PTEE) 等,另一种为可降解材料如聚乙二醇酸( Polyglycolic acid , PGA) 、聚丙醇酸( Poly Lactic acid ,PLA) 、聚乙醇酸( Poly L - lactic acid , PLLA) 及上述材料的聚合物。人工材料尽管有许多优点, 但其在降解过程中会产生酸性反应,导致无菌性炎症,不利于种子细胞的存活。同时亲水性差, 细胞吸附力较弱,机械强度不足。天然材料如弹性蛋白胶原蛋白等包含有特殊氨基酸序列:精氨酸- 甘氨酸- 天门冬氨酸。可促进细胞吸附和保留分化功能, 促进细胞种植。目前利用上述材料已能合成组织工程血管,但血管的顺应性要与人体血管顺应性相匹配,则尚有相当的距离。2. 3. 同种异体血管移植的现状 1955 年Shaw 和Wheelock 报道用冷冻同种异体静脉作股动脉旁路术后,文献中相继报道了戊二醛化学处理、低温冷冻、冻干、辐照、去除内膜和去除所有细胞成分等方法。1986 年, Pratt 等[ 3 ] 用冷冻干燥处理的同种异体股动、静脉重建兔下肢动脉2 个月后,动脉和静脉移植段的通畅率分别为93 %和66 %。1998 年,Dortland[ 4 ]用冻干的犬动、静脉重建异体下肢血管后,远期通畅率达64 % ,在20 世纪60～70 年代国外已进行动物的同种异体静脉或动脉的移植研究, 但由于种种原因均未得到满意的效果。目前, 国外正在开展自体内膜化异体血管的研究及细胞基质的研究。有文献报道,以新生儿脐带做为血管移植材料具有来源方便、易取、无属支、有一定的柔软性和屈曲性,同时由于是同种异体间血管移植,具有排斥性小、远期通畅率高等优点。2. 4 异种异体移植材料 Thiede[ 5 ] 通过对大鼠静脉进行移植观察免疫反应,发现随遗传差异增大,异体血管的抗原性增强, 表现为单核细胞浸润等。经灭活后的异体材料则存在着许多缺陷, 其中生物力学特性的差异就是一个尚待解决的问题。许多研究表明,宿主动脉与移植材料间的弹性不相适应,即顺应性差异是导致局部血流动力学改变、内膜增生,甚至移植失败的重要原因之一。3 血管顺应性的研究血管顺应性是指在压力作用下使血管容积增大而不破裂的一种特性。反映血管力学性质, 是一个衡量血管腔可扩张度的重要指标。随着对其应用意义的逐步认识,顺应性作为血管弹性指标已广泛应用于心、脑血管疾病的诊断和疗效分析、预后评估,以及血管外科供体材料的选择, 术后追踪观察等方面。血管顺应性越大,则血管的可扩张度越大,血管的弹性越好;反之, 若血管顺应性越小, 说明血管的可扩张度越小, 或者说血管越硬。移植血管和宿主动脉的顺应性差异是移植早、晚期失败的原因之一[ 6 ] ,轴向应变对血管的顺应性变化有明显影响[ 7 ] 。近年来,随着生物力学在医学领域的渗透和发展,血管的力学特性也日趋受到临床医学工作者的重视。血管外科的发展与血管移植材料的发展密切相关,能否找到理想的血管移植材料是血管移植成功与否的关键。通畅率是评价血管手术成败最常用的指标,许多研究表明, 动脉的吻接、修复移植都涉及到血管壁力学特性的改变, 进而直接或间接地影响着术后重建血管的通畅率。4 问题与展望血管工程学作为一门新的前沿科学,近年来取得了飞速发展,但最终广泛应用于临床仍有许多问题需要解决。组织工程化血管能否长期耐受血流应力的作用,尚需大量动物实验和临床试验来证实,虽然存在各种各样的困难, 但随着新技术方法的出现和应用,将为血管工程学注入希望和活力,它将以其独特的优势在细胞、分子生物学基础研究和疾病治疗中发挥重要作用。