王新军医生的科普号

斜颈分为先天性肌性斜颈和先天性骨性斜颈。先天性肌性斜颈是由于一侧胸锁乳突肌挛缩引起的头颈歪斜的先天性颈部畸形，多见；先天性骨性斜颈是因颈椎骨质发育畸形所致的斜颈，较少见。 先天性肌性斜颈的病因目前不明。有学者认为子宫内压力异常或胚儿胎位不正是产生先天性肌性斜颈的主要原因。难产及使用产钳是引起肌性斜颈的原因之一；还有1/5的患儿有明确的家族史。 表现多是一斜颈畸形，婴儿出生后其母亲可发现患儿头部向患侧倾斜，面部向健侧旋转，下颌指向健侧肩部。2～3周后斜颈畸形更加明显。将头转向健侧明显受限，症状较轻者应仔细观察才能发现。此症状随着患儿的生长发育日益加重；二颈部肿块，一般在出生后或出生后2周内可触及颈部肿块，位于胸锁乳突肌中下段，以发生于右侧者多见。此肿块呈梭形，无压痛，一般在1～2个月后达到最大，之后逐渐缩小至完全消失。 对小儿的先天性肌性斜颈，超声检查能够准确地与颈部其他疾病鉴别，如颈部囊性淋巴管瘤、颈部淋巴结肿大等。尤其就诊时肿块已消失者,超声检查更为重要。 如果确诊，对于半岁以内的患儿，采取非手术治疗均可获得满意的疗效。有明确的手术适应症的，可以采取手术治疗。

颅骨骨折按骨折部位分为颅盖与颅底骨折；按骨折形态分为线形骨折、凹陷骨折、粉碎骨折；按骨折与外界是否相通，分为开放性与闭合性骨折。开放性骨折包括颅底骨折伴有硬脑膜破裂而伴发外伤性气颅或脑脊液漏。 一般情况下，颅底骨折多数无需特殊治疗，而要着重处理合并的脑损伤和其他并发损伤。如耳鼻出血和脑脊液漏，以免引起颅内感染。多数脑脊液漏能在两周左右自行停止。持续四周以上或伴颅内积气经久不消时，应及时手术，进行脑脊液瘘修补，封闭瘘口。伴脑脊液漏的颅底骨折属于开放伤，需住院给予抗生素治疗。 颅骨骨折的预后主要取决于骨折的部位、并发症存在与否及处理是否及时。如果颅骨骨折没有造成血管破裂、脑膜损伤及颅脑损害等其他并发症，保守治疗后大部分愈合较好。

脉络丛乳头状瘤起源于脑室脉络丛上皮细胞，可发生于脉络丛上皮或脑室壁胶质细胞，大部分肿瘤具有分泌脑脊液的特性，一般生长缓慢，极少发生恶变，临床上男性多于女性。除头痛、恶心、呕吐等症状外，患者早期可有癫痫发作，后期可表现为易激惹、精神不适及视物模糊等。其主要表现为脑积水而产生的颅高压症状。这主要由于肿瘤过多 地分泌脑脊液，阻塞脑脊液循环，或是由于肿瘤出血引起蛛网膜下腔粘连所致。病程长短不一，平均1.5年左右，2岁以内患儿病程约2个月，2岁以上可达6个 月。可以有颅内压增高和局限性神经损害两大类表现除头痛、恶心、呕吐等症状外，患者早期可有癫痫发作，以后可表现为易激惹、精神不适及视物模糊等，但局灶症状常不明显。部分患者可有淡漠，甚至意识改变，出现急性颅内压增高表现。根据临床表现及辅助检查资料，一般可以做出明确诊断。但仅由影像学检查不能可靠区分脉络丛乳头状瘤与脉络膜癌。其 治疗全切肿瘤是治愈脉络丛乳头状瘤的惟一疗法。开颅前可行脑脊液外引流，以降低颅内压和减少对脑组织的牵拉损伤。切除肿瘤前注意阻断供血动脉以利于手术中 减少出血，对于未能完全切除肿瘤而不能缓解脑积水者，应当作分流手术，如为脉络丛乳突状癌术后应予放射治疗。对于未完全切除脉络丛乳突状瘤应行局部放射治 疗，对降低复发率、延长生存期有效，全脑或脑脊髓放疗比起局部放疗并没有显著差异；对有复发征象或恶性变者也应做放射治疗。

颅底骨折而引起的急性脑脊液鼻漏或耳漏绝大多数可以通过非手术治疗而愈，只有少数持续3～4周以上仍然不愈者始考虑手术治疗。其治疗原则如下：一、非手术治疗：一般采用头高30°卧位，卧向患侧使脑组织沉落在漏孔处以利贴附愈合，同时，应清洁鼻腔或耳道，以避免擤鼻咳嗽及用力屏气等，保持大便通畅，限制液体入量，适当应用减少脑脊液分泌的药物，如醋氮酰胺、 甘露醇利尿脱水。必要时亦可行腰穿以减少或停止漏液，约85%以上的脑脊液鼻漏和耳漏病人经过1～2周的姑息治疗都可以得到愈合二、手术治疗：只有在漏孔经久不愈或自愈后多次复发时才需行脑脊液漏修补术。其方法是：1.脑脊液鼻漏修补术：术前必须认真作好漏孔的定位，确定漏口位置之后，可行患侧或双侧额部骨瓣开颅，首先应通过硬脑膜外探查，按术前确定的部位，将硬膜自额窦后壁眶顶蝶嵴或筛板区小心分离，凡漏孔所在处常可见硬脑膜增厚并陷入骨折缝中，应尽量靠近颅骨分离，勿使漏口扩大，颅骨破孔处的软组织电灼后推入骨缝内，如为窦壁则推入窦腔，再用骨蜡或医用凝胶封闭颅骨裂口，然后密切缝合或修补硬脑膜上的破孔。通常多用颞肌筋膜、骨膜或帽状腱膜作为修补片缝合。2.脑脊液耳漏修补术：术前必须查明耳漏的具体部位，由颅中窝骨折累及鼓室盖使脑脊液直接进入中耳腔，经破裂耳鼓膜流至外耳道属迷路外耳漏；因颅后窝骨折累及迷路使蛛网膜下腔与中耳腔交通者属迷路内耳漏，两者手术入路不同，采用颞枕骨瓣开颅可修补颅中窝耳漏，向中窝内侧分离时免损伤岩大浅神经三叉神经脑膜中动脉及海绵窦，缝补一般均以肌肉或筋膜片蘸医用胶粘堵，其上再加带蒂肌肉覆盖固定。术毕严密缝合头皮各层不放引流。术后应降低颅内压并强力抗菌治疗。3.脑脊液伤口漏(皮漏)：首先应认真进行非手术治疗，大力控制感染，同时在距伤口漏以外(>6cm)头皮完好处，行脑室穿刺或行对侧脑室穿刺持续引流，或经腰穿置管引流脑脊液，调节引流量至漏口停止溢液为度，伤口漏处如无急性炎症可剪除皮缘坏死部分然后全层缝合，若有急性炎症应清除脓液、腐朽组织，待急性炎症控制后再次期缝合或于肉芽面上种子植皮消灭创面封闭漏口。

儿童侧脑室脉络从钙化有很多原因，有生理性的和病理性的。病理性大多见于甲状旁腺功能低下、结节性硬化、脑面部血管瘤病、侧脑室脉络丛乳头状瘤等，病理性改变不单单纯是脉络丛钙化，还要有脑部其他部位的钙化，甲状旁腺功能低下要有抽搐、血钙低、血清甲状旁腺素下降，但这钙化多对称,包括双侧丘脑。 对于病理性和生理性鉴别,需要脑CT 脑磁共振和血清学检查综合分析.

王新军 △，武跃辉，李培栋，寿纪新， 刘泉，单峤郑州大学第五附属医院神经外科 郑州 450052△ 通讯作者：王新军，博士生导师，主任医师，教授；研究方向：脑肿瘤的基础研究和综合临床治疗，E-mail:wangxj@zzu.edu.cn关键词：胶质母细胞瘤；Bcl-xL；ACNU；细胞增殖摘 要: 目的 探讨嘧啶亚硝脲（nimustine，ACNU）对胶质母细胞瘤A-172细胞Bcl-xL mRNA和蛋白表达及细胞增殖活性的影响。方法 用免疫组化染色SP法、RT-PCR和MTT法分别检测对照组和不同浓度ACNU作用于人胶质母细胞瘤A-172细胞后Bcl-xL mRNA和蛋白的表达以及细胞增殖活性的影响。结果 不同浓度ACNU作用A-172细胞后Bcl-xL mRNA相对含量均高于对照组（P＜0.01），随着ACNU浓度的增加，Bcl-xL 蛋白表达逐渐下降，而对细胞增殖活性的抑制率逐渐增高；当ACNU为25ug/ml时细胞增殖抑制率增幅最大为54.48%。结论 A-172细胞中 Bcl-xL mRNA和蛋白的高表达。ACNU可以诱导降低胶质瘤细胞Bcl-xL的表达，促进其细胞凋亡，对A-172细胞增殖活性具有明显抑制作用。Effection on Bcl-xL mRNA and Protein Expression Induced and Proliferation Inhibitory by ACNU in Human Glioblastoma A-172 Cell Lines Wang Xinjun1 , LI Peidong2, SHOU Jixin2,ZHAO Hongyang1 LIU Quan2,ZHAO Zhongwei3, SHAN Qiao21） Department of Neurosurgery, the Affiliated Xiehe Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Technology ,Wuhan 430022 2）Department of Neurosurgery,the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University; Zhengzhou 450052 3）Henan Key Laboratory of Tumor Pathology, Zhengzhou 450052Key words: ACNU；Bcl-xL； A-172 cells; proliferationAbstract: Objective The objective of this study was explored the effect of ACNU on the expression of Bcl-xL mRNA and protein and the activity of the proliferation inhibitory in human glioblastoma A-172 cell lines. Methods Human glioblastoma A-172 cells was cultured with defferent ACNU, Bcl-xL mRNA and protein expression were detected by SP immunohistochemical staining and RT-PCR methods,and the activity of the proliferation inhibitory was detected by MTT method. Results The relative content of Bcl-xL mRNA after treated by defferent ACNU were significantly higher than those in control groups(P

Bcl-XL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲体外治疗恶性胶质瘤的实验研究 王新军 ， 武跃辉, 李培栋，付旭东， 寿纪新，刘泉郑州大学第五附属医院神经外科 郑州 450052[摘要] 目的：探讨Bcl-XL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲（ACNU）体外治疗恶性胶质瘤的治疗作用。方法：采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸体外治疗法、RT-PCR、MTT法和流式细胞术对恶性胶质瘤细胞进行了体外治疗。结果：Bcl-XL反义寡核苷酸联合ACNU治疗组对肿瘤细胞抑制率为88.63%，对Bcl-xL mRNA表达的抑制率为88.76%，并可显著下调BCL-XL蛋白的表达。肿瘤细胞凋亡率为80.54%，与对照组、空白组、NODN组、ACNU和ASODN组相比较，均具有显著差异（P＜0.05）。结论：Bcl-XL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲可有效抑制恶性胶质瘤的细胞增值，Bcl-XL高表达是恶性胶质瘤对嘧啶亚硝脲耐药的又一重要因素，通过反义寡核苷酸下调BCL-XL的表达，可显著增强恶性胶质瘤对嘧啶亚硝脲的敏感性，为恶性胶质瘤的临床治疗提供又一理论依据。[关键词] BCL-XL；反义寡核苷酸；嘧啶亚硝脲；恶性胶质瘤细胞[中图分类号] R730.5 [文献标识码] A [文章编号]Therapeutic Effection of Bcl-Xl Antisense Oligodeoxynucleotide Combination With Nimustine in Human Glioblastoma Wang Xinjun1 , LI Peidong2, SHOU Jixin2,et al.1） Department of Neurosurgery, the Affiliated Xiehe Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Technology ,Wuhan 430022 ;2）Department of Neurosurgery,the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University; Zhengzhou 450052 ;3）Henan Key Laboratory of Tumor Pathology, Zhengzhou 450052Abstract:[Objective] To study the therapeutic effection of Bcl-XL antisense oligodeoxynucleotide(ASODN) combination with nimustine(ACNU) in human glioblastoma A-172 cell lines. [Methods] The methods of targeted therapy with cationic liposome-mediated ASODN in vitro, RT-PCR ,MTT assay and flow cytometry were used to systemlly study. [Results] The group of ASODN combination with ACNU, the proliferation inhibitory rate is 88.63%, the expression inhibitory rate of BCL-XLmRNA is 88.76%, the expressin of Bcl-xL was decreased significantly.The apoptosis rates by flow cytometry is 72.38±8.16%, there are significant difference between the combination group and the cell control group,the vacuitycontrol group, the NODN group,the ASODN group and the ACNU group,respectively(P＜0.05).[Conclusion] The Bcl-XL antisense oligodeoxynucleotide combination with ACNU could effectively inhibit the proliferation of glioblastoma cells,bcl-xl is an important factor for ACNU resistance and the suppression of BCL-XL expression by the specfic antisense oligodeoxynucleotide can significantly increase the sensitivity of glioblastoma cells to ACNU.It would offer an important therapeutic foundation to clinical therapy of maligent glioma.Keywords:bcl-XL；antisense oligodeoxynucleotides；Nimustine；maligent glioma.胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,在临床实践中，对胶质瘤的治疗尽管进行了多种多样的研究及尝试，但至今临床治疗仍是一个世界性难题[1]。化疗作为综合治疗的重要手段，疗效不理想，重要原因一是大剂量给药产生的副作用，二是耐药。反义基因治疗具有高特异性、高生物活性和低毒性的优点，是肿瘤基因治疗的重要手段。但二者联合治疗对恶性胶质瘤研究甚少，本研究用嘧啶亚硝脲（Nimustine，ACNU）联合Bcl-XL反义寡核苷酸对恶性胶质瘤治疗进行探讨，现报告如下。1 材料与方法1.1 主要试剂 胶质母细胞瘤A-172购于上海细胞所。反义BCL-XLmRNA硫代寡核苷酸（ASODN）的序列链为5'-AAAGTATCCCAGCCGCCGTT-3'，无关序列寡核苷酸（NODN）序列为5'-CATATCACGCGCGCACTATG-3'，Bcl-xL引物序列：上游：5’-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3’；下游：5’-GCGATCCGACTCACCAATAC-3’扩增片段为448bp。β-actin参引物序列：上游：5’-ATGTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’；下游：5’- CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’扩增片段为502bp，均由北京奥科生物工程公司合成。MTT（噻唑蓝）购自Santa Cruz公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养与分组 将冻存的人胶质母细胞瘤A-172细胞株复苏后接种于RPMI 1640培养基中孵育箱内培养。将生长良好的A-172细胞用0.2%胰蛋白酶消化、离心收集后调整浓度为1×106，重新分别接种于预置有盖玻片的96孔板中和25cm2的培养瓶中。并于接种后48h分组治疗：细胞对照（A组）、空白对照（B组）、NODN（C组）、终浓度为200ug/mlASODN（D组）、25ug/mlACNU（E组）及ASODN和ACNU的联合治疗（F组）。在细胞培养状态下，每24h用倒置显微镜观察各组细胞生长状态和形态学改变。72h后收集各组细胞进行相关检测。1.2.2 细胞增殖活性的测定（MTT法） 治疗72h后，在不弃去RPMI 1640培养液的情况下，每孔中加入20ulMTT液，37℃，5%CO2孵育箱内4h，弃去上清液，每孔加入100ul二甲亚砜振荡后，用MTT法，在酶标仪上测550nm处个孔的光吸收值，以细胞琥珀酸氧化脱氢酶（SDH）活性受抑制的情况作为监测方法记录结果。1.2.3细胞BCL-XLmRNA水平的RT-PCR检测 实验步骤严格按照TRIzol试剂所附的操作说明要求进行，离心收集各组细胞，提取细胞总RNA，经过紫外分光光度法定量和鉴定。在25μl的扩增体系中分别加入10×RT-PCR缓冲液2.5μl、25mmol/L MgCl25μl、10mmol/LdNTP2.5μl,RNA酶抑制剂0.5μl，AMV逆转录酶0.5μl，bcl-xL上下游引物及内参β-actin上下游引物各1μl,实验样品RNA 1μg，进行RT-PCR扩增。最后分别取6μl扩增产物在1%的琼脂凝胶中进行电泳，紫外线透视仪下观察结果，并用凝胶成像仪分析系统测定灰度值，计算Bcl-xL/β-actin的比值，获得目的片段的相对含量。1.2.4 流式细胞仪检测凋亡细胞 治疗后48h,0.2%胰蛋白酶消化细胞，离心分别制备各组单细胞悬液，作细胞计数。用Annexin V-FITC和PI合染细胞，未治疗空白对照细胞另设未染色管、单染Annexin V-FITC管及单染PI管。以Annexin V-FITC单染管和PI单染管作为基准参照，测定每个上样管数据，按所配制的软件处理、分析，选取散点图作直观显示。按试剂盒原理说明，判定标准如下：Q1区：PI(+) Annexin V(-)，坏死细胞区；Q2区：PI(+) Annexin V(+)，凋亡晚期或死亡细胞区；Q3区：PI(-) Annexin V(-)，活细胞区；Q4区：PI(-) Annexin V(+)，早期凋亡细胞区。在本试验中所测凋亡细胞数为Q2区+Q4区所得的细胞数。1.3 统计学处理 采用SPSS10.0软件对相应数据进行Ⅹ2检验、t检验、q检验及方差分析,以α=0.05作为检验水准。 2 结果 2.1 治疗后细胞形态学改变 治疗后48h,倒置显微镜下观察发现，在细胞对照组、空白对照组和无关序列寡核苷酸组，细胞均呈上皮性贴壁生长，轮廓清晰，结构紧密，生长状态良好；而在反义寡核苷酸组、ACNU治疗组合联合治疗组，细胞部分变圆浮起，细胞间接触变松，增殖速度减慢，并见细胞中颗粒增多，细胞周围碎片增多。联合治疗组细胞脱落、漂浮、皱缩更加明显。2.2 治疗后细胞增殖活性的抑制作用（MTT法） 结果见表1，按细胞对照组、空白对照组、NODN组、ACNU组、ASODN组及联合治疗组的顺序，抑制率逐渐增高。表1 BCL-XL-ASODN 联合ACNU对A-172细胞SDH活性抑制作用( ±s)组别 A 抑制率%A组 0.785±0.098 0B组 0.741±0.032 5.67C组 0.702±0.014 10.57D组 0.401±0.056 58.54E组 0.326±0.056 48.92F组 0.089±0.046 88.63注：F组、E组、D组分别与A组、B组、C组 ；F组与D组、E组相比，均P<0.01; A组、B组、C组组间及D组与E组相比，P>0.05。 2.3 治疗后细胞中BCL-XL mRNA水平的变化 结果显示，与细胞对照组相比，空白对照组及NODN组无明显变化，ASODN组、ACNU组和联合治疗组的表达依次减弱，抑制率依次增加见表2，图1。表2 BCL-XL-ASODN 联合ACNU治疗后BCL-XL mRNA的表达组别 相对表达量 抑制率（%）A组 0.98±0.11 0B组 0.96±0.14 2.04C组 0.92±0.32 6.12D组 0.48±0.26 51.02E组 0.54±0.33 44.89 F组 0.11±0.22 88.76 注：F组E组D组分别与A组B组C组相比，F组分别与D组和E组相比，均P<0.01;D 组与E组及及A组、B组、C组间两两相比,P>0.052.4 治疗后各组细胞Annexin V-FITC和PI合染结果 结果显示，凋亡细胞数按细胞对照组、空白对照组、NODN组、ACNU组、ASODN组、联合治疗组的顺序递增见表3。表3 治疗后A-172细胞FITC/PI合染结果（%） 组别 Q1 Q2 Q3 Q4 Q2+Q4A组 1.23±0.34 2.76±0.45 94.63±2.42 1.38±0.63 4.14±1.08B组 2.11±1.12 4.23±1.89 91.57±3.38 2.03±1.27 6.26±3.16C组 3.23±1.15 4.49±1.75 89.99±4.46 2.18±2.35 6.67±4.10D组 2.78±1.24 14.67±3.38 59.34±5.59 23.21±4.58 37.88±7.96E组 3.34±2.37 16.20±3.42 55.84±7.67 24.62±4.03 40.82±7.45F组 3.81±.17 29.35±3.57 23.81±5.87 43.03±4.59 72.38±8.16注：F组、E组、D组与A组、B组C组相比，F组与D组E组相比，均P<0.01D组、E组及A组、B组、C组间两两相比，均P>0.05。3 讨论在临床实践中，对恶性胶质瘤的治疗，国内外学者进行了多种多样的研究和尝试[2,3]。广泛切除和放疗，可以延长患者生存时间，但几乎所有的肿瘤患者均出现复发。化疗作为术后非常重要的治疗手段，其主要机制之一就是通过促进肿瘤细胞的凋亡而起到治疗目的的。但由于传统化疗药物几乎无一例外地都在杀死肿瘤细胞的同时，对人体正常组织及细胞也造成极大的伤害，使得化疗药物的应用至今在临床上一是受到大剂量副作用的限制，二是受耐药的影响，临床实际疗效有限。亚硝脲类药物由于其高度脂溶性，容易通过血脑屏障，可在肿瘤细胞内释放出活泼的烷化基团，造成肿瘤细胞的DNA损伤，最终导致肿瘤细胞死亡，是治疗恶性胶质瘤的首选药物，但其实际临床有效率仅20-32.3%%[4]。本研究结果也进一步证实，ACNU对胶质瘤细胞的抑制率和凋亡率分别只有48.92%和45.84%。因此，耐药是化疗药物疗效偏低的主要原因，是肿瘤治疗的一大难题，也是恶性胶质瘤综合治疗失败的一个重要原因[2]。许多研究表明,诱导恶性肿瘤细胞凋亡是化疗药物发挥杀伤作用的重要机制之一,而凋亡抑制基因的过度表达使肿瘤细胞对化疗药物敏感性下降，bcl-xl就是其中之一[5-8] 。自ASODN应用研究以来，已证实在体内外具有特异性抑制基因表达的能力，联合ASODN和其它化疗药物已成为肿瘤研究中非常重要策略[2,9，10]。本研究结果显示，Bcl-xl作为内源性凋亡通路中重要抑制因子，单纯经过BCL-XL ASODN下调BCL-XL的表达之后，对凋亡率的影响也只有47.27%。但是，ACNU联合BCL-XL ASODN共同作用于A-172细胞，MTT、FC的结果分别为88.63%、80.54%，明显地抑制了肿瘤细胞的生长与增殖，提高了细胞凋亡率。说明bcl-xl-ASODN对ACNU抗肿瘤具有明显的增效作用。BCL-XL ASODN转染细胞后，BCL-XL mRNA水平的表达下调了51.02%，表明：BCL-XL-ASODN进入细胞后的直接作用就是封闭BCL-XL mRNA的表达，并影响到转录后水平及蛋白质的表达。提示我们，通过下调BCL-XL表达能够显著提高ACNU的抗肿瘤作用，进而揭示出，BCL-XL在恶性胶质瘤细胞中的高表达可能是胶质瘤耐药的又一重要因子。综上所述，Bcl-XL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲可有效抑制恶性胶质瘤的细胞增值，Bcl-XL高表达是恶性胶质瘤对嘧啶亚硝脲耐药的重要因素之一，通过反义寡核苷酸下调BCL-XL的表达，可显著增强恶性胶质瘤对嘧啶亚硝脲的敏感性，为恶性胶质瘤的临床治疗提供又一理论依据。参考文献基金项目：河南省教育厅自然科学研究项目（2007320067）△ 通讯作者：王新军，博士生导师，主任医师，教授；研究方向：脑肿瘤的基础研究和综合临床治疗。

RASSF1A基因在星形细胞瘤组织中的表达及临床意义郑州大学第五附属医院神经外科; 450052 郑州王新军 ，武跃辉，高涛，李培栋,[摘要] 目的 探讨RASSF1A（RAS相关区域家族1A）基因转录表达与星形细胞瘤发生发展的关系。方法 采用半定量RT-PCR、蛋白印记法和免疫组化技术对50例手术切除的星形细胞瘤及27例正常脑组织中RASSF1A的表达情况进行检测。 结果 RASSF1A在所有正常脑组织中表达，而在星形细胞瘤组织中存在较高的表达缺失率（66%），此结果与蛋白印记法检测结果一致。星形细胞瘤组织中的RASSF1A阳性表达率（34%），与正常脑组织（100%）相比差异有显著统计学意义（x2=49.63，P＜0.01）。RASSF1A表达与患者的年龄和临床病理分级显著相关（P＜0.05）。 结论 RASSF1A转录表达缺失可能参与调控星形细胞瘤的发生发展过程，并进而影响其生物学特点及临床预后。[关键词] 星形细胞瘤； 基因表达； RASSF1A； 逆转录聚合酶链反应[中图分类号] R 730.264 [文献标识码] AThe expression and clinical significance of the RASSF1A agene in astrocytoma tissues. Wang Xin-jun, Fan Dong-mei, Wu Yue-hui, Gao Tao. Department of Neurosurgery, The Fifth Affiliated Hospital Of Zhengzhou University,( Zhengzhou 450052 , China.)[Abstract] Objective To investigate the expression of RASSF1A gene(Ras association domain family 1A gene) in astrocytoma tissues. Methods The expression level of RASSF1A gene in the astrocytoma tissues in 50 samples and human normal brain tissues in 27 samples was detected with RT-PCR,Western blot and immunohistochemisty methods. Results RASSF1A mRNA was identified in all the normal brain tissues, but not found in 66%of astrocytoma tissues. The similar result can be gain by Western blot. The loss rate of RASSF1A mRNA was related with pathological grade and the patients’age（P＜0.05）. Conclusion: Loss or abnomal down-regulation of RASSF1A mRNA is a frequent event in astrocytoma, which may play an important role in the malignant progression and prognosis of astrocytoma.[Key words] astrocytoma; Gene expression; RASSF1A; Reverse transcription polymerase chain reactionRASSF1A基因与多种肿瘤的发生、发展密切相关。目前认为该基因表达失活主要是由杂合子丢失（LOH）和启动子区特异的高甲基化造成，尤其是RASSF1A启动子区的高甲基化，已经在广泛肿瘤谱中被发现。但目前有关RASSF1A基因在星形细胞瘤组织中的转录表达以及与临床病理关系的研究报道甚少，为此本研究对星形细胞瘤组织进行了RASSF1A基因表达的检测，旨在探讨RASSF1A基因与星形细胞瘤发生发展的关系。1 资料与方法1.1 一般资料收集我院选取2001～2006年手术切除的新鲜髓母细胞瘤标本50例，其中男33例，女17例，年龄8～47岁，平均14.1±2.4岁。全部标本均经病理确诊，按WHO分级，Ⅰ级7例，Ⅱ级4例，Ⅲ级22例，Ⅳ级17例。另随机选取27例同期颅脑损伤患者手术获得的无神经系统肿瘤的正常脑组织标本作正常对照,对照组男性20例，女性7例，年龄21～51岁，平均37.9±4.2岁。标本收集时， 从被切除标本的癌灶中央无出血坏死部位切取癌组织标本，并切取正常脑组织作为对照。标本一次性取材200mg,立即放入-80℃冰箱保存，其余组织均常规做石蜡包埋切片，切片厚4μm，1张切片做HE染色复查诊断和组织学分级，另一张做RASSF1A的免疫组化染色。1.2 主要试剂逆转录试剂盒及PCR相关试剂均购自Promega公司（美国）RASSF1A及二抗购自Santa Cruz Biotechology公司（美国），抗羊S-P试剂盒购自福州迈新公司，Trizol试剂及Western印迹系统购自Invitrogen公司（美国）。1.3 方法1.3.1 半定量RT-PCR：取低温保存的的标本50～100mg，加Trizol试剂匀浆后抽提出总RNA。取2μg总RNA进行逆转录，以2μl逆转录产物作为半定量PCR的模板，建立PCR反应体系，具体方法参照试剂盒说明书进行。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。RASSF1A引物序列：上游引物：5＇-TGGAGCGGGACACGAACG-3＇，下游引物：5＇-TGCGGCCTGACACTT-3＇，扩增产物片段长度为267bp。以β-actin内参照，其上游引物序列为5＇-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3＇，下游引物序列为5＇-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3＇，扩增产物长度为317bp。PCR反应条件：94℃ 4min后，以60℃作为退火温度循环30次，72℃延伸10min。取8μl反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察电泳结果，用Flour-STM凝胶成像系统进行图像保存和分析。1.3.2 蛋白印迹法（Western blot）：取低温保存的标本，在蛋白裂解液中充分匀浆，高速离心后取上清液，测定蛋白浓度。取100μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，用半干转膜仪将蛋白转置硝酸纤维膜上。封闭后依序加一抗（1：150）和二抗（1：750），最后用NBT-BCIP进行显色。1.3.3 免疫组化方法：根据抗羊S-P试剂盒说明书进行操作，并常规设立阴性和阳性对照。1.4 统计学分析 应用SPSS13.0统计学软件，对本组资料进行配对t检验、卡方检验及相关性分析。2. 结果2.1 RASSF1A mRNA和蛋白在星形细胞瘤组织中的表达 所有正常脑组织中RASSF1A mRNA均全部阳性表达（27/27），RT-PCR产物电泳结果显示，在267bp处可见阳性条带；而50例星形细胞瘤组织中有33例表达缺失，表达缺失率为66%（33/50）。二者相比差异有统计学意义（P＜0.001。蛋白印迹法检测结果与PCR法结果完全一致。2.2 免疫组化染色结果 RASSF1A主要分布于胞核中，以＞10%的瘤细胞胞核内出现深棕黄色为阳性结果，着色弱者则为阴性。星形细胞瘤的RASSF1A的阳性表达率为34%，正常脑对照组中阳性表达率为100%，两者相比差异有统计学意义（χ2=49.63，P＜0.01）。2.3 不同临床病理指标的星形细胞瘤组织中RASSF1A mRNA的表达 见表1。RASSF1A mRNA的表达缺失与星形细胞瘤的病理分级和年龄明显相关，随着病理分级的增加而显著升高（P＜0.05）。表 1 不同临床病理指标的星形细胞瘤组织中RASSF1AmRNA的表达类别 n RASSF1AmRNA缺失例数 表达缺失率（%） χ2 P值病理分级Ⅰ级 7 2 28.5Ⅱ级 4 2 50.0Ⅲ级 22 17 77.2 6.916 0.031Ⅳ级 17 16 94.1年龄≦40岁 41 37 87.7 ＞40岁 9 2 22.2 6.934 0.008讨论RAS相关区域家族1A（RASSF1A）基因是Dammann等[1] 于2000年报道从3号染色体短臂克隆出来的新型候选抑癌基因，因其表达产物中含有与RAS蛋白结构相关区域，因而得名。RASSF1A基因与ras的效应基因同源，位于3号染色体短臂3p21.3。1998年Sekido等首次将该缺失区确定在一个120kb的最小纯合缺失区内[2]。现已发现，RASSF1A基因由于选择性剪接和启动子的不同，形成3个主要的转录本，即RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C，其中最普遍最重要的是RASSF1A[3，4]。RASSF1A基因的cDNA全长为1873bp，内含编码340个氨基酸的开放阅读框架，由6个外显子顺序拼接而成，依次分别为1α、2αβ和外显子3～6。外显子3～6编码Ras相关区域[5]。RASSF1A基因在所有正常组织中均表达，在绝大多数恶性肿瘤组织中却表达缺失。RASSF1A作为抑癌基因的作用机制目前尚不明确，可能通过以下机制发挥作用：①RASSF1A基因可能就是编码着Ras促进细胞凋亡作用的特有效应蛋白，它的失活破坏了Ras的平衡作用，导致了细胞的恶性转换[5]；②RASSF1A基因可能通过与微管结合调节中心体和纺锤体的功能，进而调节微管的稳定性，RASSF1A还可能与Cdc20结合抑制后期促进联合体（APC）来调节有丝分裂的进展[6]；③RASSF1A可抑制CyclinD1的积聚，并能增强p120(E4F)和cyclin2基因启动子结合，抑制cyclin2表达，从而阻滞细胞周期G1期向S期转变[7，8]。在本实验中，我们发现RASSF1A在正常脑组织中均表达，而在星形细胞瘤组织中存在较高的基因表达缺失，两者有显著差异（P <0.01），说明RASSF1A表达的缺失，在mRNA转录水平表达失活而丧失了对星形细胞瘤发生的抑制作用，可能是导致星形细胞瘤形成的一个重要原因，RASSF1A基因可能是星形细胞瘤的重要相关抑癌基因之一。在RASSF1A半定量分析中发现，RASSF1A基因表达缺失与星形细胞瘤患者年龄和病理分级密切相关。肿瘤恶性程度越高，RASSF1A基因表达缺失率就越高，特别是在Ⅲ级和Ⅳ级组更为明显，这一实验结果与本组病例的临床资料、术中所见相符，与文献报道一致[9]。RASSF1A基因表达缺失与年龄的关系，与文献不同[10]，有待于进一步对随访病例的观察和研究。总之，无论免疫组化还是RT-PCR和蛋白印记法检测，RASSF1A基因在星形细胞瘤组织中都显示明显表达缺失，说明RASSF1A基因表达缺失可能在星形细胞瘤恶性进展中发挥一定作用, 检测RASSF1A可作为一种有潜在应用价值的生物分子指标来用于星形细胞瘤的早期诊断和预后的判断。参考文献1. Dammann R, Li C, Yoon JH, et al. Epigenetic inactivation of a Ras association domain family protein from the lung tumor suppressor locus 3p21.3[J].Net Genet,2000,25(3):315-319.2. Sekido Y, Ahmadian M, Wistuba II,et al. Cloning of a breast cancer homozygous delection junction narrows the region of search for a 3p21.3 tumor suppressor gene[J]. Oncogene,1998,16(24):3151-3157.3. Tommasi S, Dammamn R, Jin SG,et al. RASSF3 and NOREA:identification and cloning of two human homologues of the putative tumor suppressor gene RASSF1A[J]. Oncogene,2002,21(17):2713-2720.4. Yu MY,Tong JH,Chan PK,et al.Hypermethylation of the tumor supressor gene RASSF1A and frequent concomitant loss of heterozygosity at 3p21 in cervical cancers[J]. Int J Cancer,2003,105(2):204-209.5. Vos MD, Ellis CA, Bell A,et al. Ras use the novel tumor suppressor RASSF1 as an effector to mediate apoptosis[J].J Biol Chem,2000,275(46):35669-35672.6. Song MS,Song SJ, Avad NG,et al. The tumor suppressor RASSF1A regulates mitosis by inhibiting the APC-Cdc20 complex[J]. Nat Cell Biol,2004,6(2):129-137.7. Pfifer GP, Dammann r. Methylation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human tumors[J].Biochemistry(Mosc),2005,70(5):576-583.8. Ahmed-Choudhury J, Aqathanqqelou A, Fenton SL, et al. Transcriptional regulation of cyclin A2 by RASSF1A through the enhanced binging of p120E4F to the cyclin A2 promotor [J].Cancer Res,2005,65(7):2690-2697.9. Schagdarsuregin U, Gimm O, Hoang Vu C,et al. Frequent epigenetic silencing of the Cp G island promoter of RASSF1A in thyriod carcinoma[J]. Cancer Res,2002,62(13):3698-3701.10. Maruyan R, Toyooka S,Toyooka KO,et al. Aberrant promoter methylation profile of profile of prostate cancers and its regulationship to clinicopathological features[J]. Clin Cancer Res,2002,8(2):514-519.

外伤性癫痫(post-traumatic epilepsy, PTE)是继发于脑损害引起的癫痫样发作,占所有癫痫的5%,症状性癫痫的20%,战时颅脑损伤患者癫痫的发生率高达34%,这是一个巨大的医学和社会问题[1]。目前对PTE缺乏有效的治疗方法,绝大部分患者容易发展为难治性癫痫,主要原因是对外伤性癫痫的发病机制尚未清楚。近年来,许多学者们已意识到外伤性癫痫的危害性,注重外伤性癫痫的理论和临床研究,我们于2005年7月至今在术中皮层和深部脑电图的监测下,联合使用多种手术术式治疗外伤性癫痫患者240例，效果满意,报告如下。1.一般资料1.1临床资料 男180例,女60例;年龄16~45岁,平均为26.8岁;病程4~12年,平均6.4年。均有颅脑外伤史,其中170例有开颅手术史。均有全面性发作病史,每月发作2~3次至每日10余次。均经抗癫痫药物治疗效果无效。1.2脑电生理检查 均进行常规脑电图和24小时长程视频脑电图检查,发现178例在慢波的背景上有局灶波出现,54例有双侧广泛弥漫性棘波、尖波或棘慢综合波发放(左额右颞均有)，另8例多次检查结果均为阴性。1.3电子计算机体层扫描(CT)及磁共振成像(MRI) 有明显局限性脑软化灶200例,MRI检查均表现为不同程度的长T1、长T2信号，有明确海马结构萎缩40例。1.4正电子发射体层扫描(PET) 缺点是费用昂贵、放射性核素不易获得且对人体有一定的损害。故患者选择较少。2方法2.1病例筛选外科手术是治疗顽固性外伤性癫痫的一种有效的治疗途径,约半数以上外伤性癫痫患者经手术治疗可取得满意疗效[2],但有相当多的患者在此期间内发作可能减少或消失,因此选择手术时机及适应证也是非常关键的。一般手术不宜在癫痫初发后3~4年内进行。2.2手术方法全麻插管, 根据术前影像和电生理检查结果,以脑软化灶为中心同时兼顾棘波发放区域设计头皮切口,尽量暴露影像学检查正常而脑电不正常的皮层组织。硬脑膜切开后, 对脑膜和瘢痕脑组织之间的粘连应充分松解,同时注意保持软脑膜的完整;粘连分开后,先用皮层电极作“地毯式”描记,病变位于颞叶或邻近颞叶者常规行患侧海马-杏仁核深部脑电监测。手术均在显微镜下进行，行致痫灶切除70例; 致痫灶+多处软膜下横切术(multiple subpialtransection,MST)/热灼术121例; 致痫灶+颞前叶、杏仁核-海马切除+皮层热灼术42例;胼胝体切开+MST+皮层热灼7例。直至手术野可用电极探查的范围内癫样放电全部或大部消失，手术才结束。所有病例致痫灶切除后均送病理检查。术后常规抗癫痫药物治疗。3.结果其疗效以谭氏分级[3]为标准,满意106例(44.2%),显著改善93例(38.8%),良好26例(10.8%),效果较差8例(3.3%),无改善7例2.9%)。本组无手术死亡。术后病理：送检标本一般为脑组织内胶质细胞增生,部分神经细胞核固缩变性坏死,部分区域神经细胞肿胀,含铁血黄素沉积伴局部有灶性钙化。4.讨论PTE是继发于脑外伤引起的癫痫样发作,为颅脑外伤后的严重并发症之一,它在原发损伤的基础上进一步加重了脑组织的病理损伤及神经生化改变,恶化了病情,增大伤亡风险,使治疗更趋复杂。Rinaldi等[2]报道,平时颅脑损伤病人伤后癫痫发生率为1%~10% ,战时颅脑损伤病人癫痫的发生率高达34%。因此,PTE早已引起广大神经外科医生的高度重视。一部分PTE患者通过药物即能达到很好的治疗效果，但仍有相当部分患者通过药物无法控制癫痫发作，需行外科手术治疗。目前国内外治疗癫痫的手术方式通常分成两大类[4]:经典的致痫灶切除性手术和阻断癫痫放电传播通路的功能性手术。常用的致痫灶切除性手术包括脑皮质致痫灶切除术、颞叶切除术、选择性杏仁核-海马切除术等。常用的功能性手术包括胼胝体切开术、MST、皮层热灼术等。部分外伤性癫痫患者致痫灶常为多源性,如果只使用一种上述手术方式常难以奏效。另外，手术中癫痫灶的准确定位是手术成功的关键因素，因此,我们根据术中ECoG和深部电极检测结果以及棘波发放的传播机制,选择一种相应的术式或将多种不同术式联合使用来治疗外伤后癫痫。从而提高手术效果。参考文献＊郑州市科技发展计划资助项目，083SGYS33262-12