[摘要] 目的:明确以端粒酶活性水平变化作为卵巢上皮性癌药敏检测指标的可行性,为临床提供一种新的体外药敏检测方法。方法:以TRAP-PCR-ELISA法检测卵巢上皮性癌中端粒酶活性,并测定用药后端粒酶活性变化,以端粒酶活性下降计算肿瘤细胞生长抑制率,以此作为评价化疗药物敏感性的指标,并与MTT法测定结果及临床疗效相比照。结果:SKOV3细胞数量与端粒酶活性呈正相关。卵巢上皮性癌中端粒酶阳性率为86.36%。在11例卵巢上皮性癌原代培养中,6例端粒酶活性大于2U者对CDDP均不敏感,4例(66.67%)对ADM不敏感。CDDP、ADM作用后,端粒酶活性下降超过30%者分别为9例(81.82%)、9例(81.82%),MTT法测定肿瘤细胞生长抑制率在30%以上者分别为4例(36.36%)、7例(63.64%),两种方法与临床疗效符合率分别为90.91%、63.64%及90.91%、72.73%。结论:端粒酶活性增高程度与卵巢上皮性癌对CDDP、ADM的敏感性有关,用药前后端粒酶活性下降程度可作为卵巢上皮性癌体外药敏检测指标。[关键词] 端粒酶 卵巢上皮性癌 药物敏感性A study of telomerase activity as chemotherapy sensitivity marker of ovarian epithelial carcinoma in vitro Qu Quanxin, Mi Ruoran, Guo Hualing. Department of Obstetrics and Gynecology, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin, 300052,China[Abstract] Objective To study the feasibility of telomerase as sensitivity marker for ovarian epithelial carcinoma in vitro. Methods The activity of telomerase in ovarian epithelial carcinoma were tested by TRAP-PCR-ELISA before and after CDDP and ADM treatment and calculate the inhibition rateof tumor cells according to the degree of decrease of telomerase activity. The result were contrasted with that of MTT. Results The number of SKOV3 cells was positive relationship with telomerase activity. The positive rate of telomerase activity in ovarian epithelial carcinoma was 86.36%. 6 cases which telomerase activity more than 2U were not sensitive to CDDP, 4 cases(66.67%) to ADM in 11 primary ovarian epithelial carcinoma culture. The telomerase activity decrease more than 30% after CDDP and ADM treatment were 9(81.82%) and 9(81.82%), respectively. The inhibition rate tested by MTT more than 30% were 4(36.36%) and 7(63.64%), respectively. The clinical correspondence of the two methods were 90.91%, 63.64% and 90.91%, 72.73%, respectively. Conclusions The degree of increase of telomerase activity was relationship with the sensitivity of ovarian epithelial carcinoma to CDDP and ADM. The degree of decrease of telomerase activity after CDDP and ADM treatment could become the marker to value the sensitivity of ovarian epithelial carcinoma in vitro.[Key words] Telomerase Ovarian epithelial carcinoma sensitivity近30年来,关于体外化疗药物敏感性测定方法的研究异常活跃,但由于各种技术上的限制,使药敏检测结果与临床治疗反应之间出现很大差异,如何消除肿瘤组织中多种正常细胞成分的干扰,是解决这一问题的关键。由于端粒酶在正常细胞与恶性肿瘤细胞中表达水平存在差异,如果端粒酶活性改变能作为判断化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应,则端粒酶将有望成为一种新的体外药物敏感性检测指标,极大地提高检测结果的准确性及可靠性。1.材料与方法1.1 材料1.1.1卵巢上皮性癌细胞系SKOV3:SKOV3细胞端粒酶呈阳性,确定肿瘤细胞数量与端粒酶活性水平之间的关系,有助于判断中由于卵巢上皮性癌组织原代培养细胞中存在不均质性,既有肿瘤细胞,又有其他成分的细胞,由中国医学科学院天津血液病研究所药物室提供,在RPMI1640加10%胎牛血清,37℃5%CO2饱和湿度环境下培养传代。1.1.2 卵巢上皮性癌组织的原代培养:22例卵巢上皮性癌组织标本,取自1998年11月~1999年8月期间在天津医科大学总医院妇科手术的患者,均为卵巢浆液性腺癌,手术分期为Ⅰ期者1例,Ⅱ期者2例,Ⅲ期者16例,Ⅳ期者3例。1.1.3 主要试剂:端粒酶检测试剂盒购自德国宝灵曼(Boehringer Mannheim)公司。1.2 方法1.2.1 SKOV3细胞数量与端粒酶活性的关系:选择处于对数生长期的SKOV3细胞系,按等比稀释,浓度分别为5×105/ml、2.5×105/ml、1.25×105/ml、6.25×104/ml、3.125×104/ml、1.56×104/ml、7.8×103/ml,分别取2ml接种于6孔板,以上述方法测定端粒酶活性。1.2.2 端粒酶活性检测:以Trap-PCR-ELISA法检测卵巢上皮性癌中端粒酶活性,方法按试剂盒要求操作,标准阴性对照值(A450-A690)应小于0.25U,标准阳性对照值(A450-A690)应大于1.5U,当△A>0.2U判断为阳性。1.2.3 加药后原代培养细胞中端粒酶活性变化:调整细胞浓度为1×105/ml,取2ml接种于6孔板,继续培养12小时,加入CDDP 10μg/ml、ADM 1μg/ml,继续培养72小时终止,测定端粒酶活性。1.2.4 MTT法测定肿瘤细胞抑制率:按文献方法操作[1]。CDDP 10μg/ml、ADM 1μg/ml,每组设24个重复孔。按以下公式计算肿瘤细胞抑制率。当抑制率≥30% 时,为药物敏感;抑制率
长期单纯雌激素刺激是造成子宫内膜增生的主要原因,如多囊卵巢综合征引起的不排卵、肥胖者脂肪组织雌激素腺外转化、合并卵巢具有内分泌功能的肿瘤、外源性雌激素治疗等。 一、子宫内膜非典型增生的病理特征 子宫内膜增生具有一定的癌变倾向,1979年,Sherman等将子宫内膜腺癌的癌前病变称为子宫内膜上皮内瘤变(endometrial intraepithelial neoplasia,EIN)。1985年,Kurman建议将子宫内膜增生分为子宫内膜单纯性增生(simple hyperplasia, SH)、子宫内膜复合性增生(complex hyperplasia, CH)、子宫内膜不典型增生(atypical hyperplasia, AH,包括单纯型不典型增生、复合型不典型增生)。长期观察证实,子宫内膜不典型增生者的癌变率为23%,子宫内膜复合性增生的癌变率为3%~5%,子宫内膜单纯性增生的癌率变为1%~2%。 1.子宫内膜单纯性增生:是指内膜腺体轻度或中度局灶性或弥漫性增生,腺体增多而密集或疏密不均,腺腔大小不等,多数呈小而圆形,部分腺腔呈囊性扩张。腺上皮细胞呈单层或复层。间质细胞增多而密集。 2.子宫内膜复合性增生:内膜腺体高度弥漫性增生,多数腺体拥挤,结构复杂,呈绒毛分枝状腺体、腺腔套腺腔或伴腺腔内乳头状皱褶等。腺上皮细胞呈局灶性或弥漫性复层。间质细胞增生密集。 3.子宫内膜不典型增生:子宫内膜腺体异常增生,腺体呈乳头状或锯齿状,相互间异常拥挤。腺上皮细胞增生活跃,层次增多而排列紊乱,失去极性,核大而不规则,染色深,核仁大。腺上皮呈发芽、分支样生长,并向腺腔内突出形成子腺体,后者可进一步延伸并融合形成腺腔内桥梁形态,局部可形成筛状结构。间质被挤而萎缩,腺体间只有少量结缔组织间隔。 二、子宫内膜非典型增生的临床诊断与治疗 1.临床诊断:患者常有长期应用雌激素或激素替代治疗、乳腺癌后他莫西芬治疗等病史。有些患者可有多囊卵巢综合征、肥胖等。育龄妇女主要表现为月经紊乱、不规则阴道出血,而在绝经后妇女则可出现绝经后阴道出血。B超检查常提示子宫内膜增厚或异常,还应注意双侧卵巢情况,以早期发现具有内分泌功能的卵巢肿瘤。血性激素检查常可发现雌激素水平增高,特别是在绝经后妇女,应警惕卵巢具有内分泌功能的肿瘤。子宫内膜活检病理检查是诊断子宫内膜病变最可靠的方法。宫腔镜下子宫内膜活检可发现微小病变,使诊刮更加全面,减少漏诊。 2.治疗:子宫内膜癌前病变的治疗主要根据患者的年龄与对生育的要求、子宫内膜增生的类型与细胞异型程度、对内分泌治疗的反应等来决定。 (1)内分泌治疗:在年龄小于40岁的患者,特别是有生育要求的单纯性增生与复合性增生患者,要在排除子宫内膜癌的前提下应用孕激素治疗,治疗期间应严密随访。在孕激素开始治疗后,每3个月应行诊断性刮宫1次。这样既能允许孕激素对子宫内膜充分发挥作用,也可及时发现对孕激素治疗无反应者,以便及时改变治疗方案。对于经孕激素治疗子宫内膜病变消失而有生育要求者,可行促排卵治疗。Kurman等报道,40岁以下患者经孕激素治疗后有25%足月分娩。对于子宫内膜轻至中度不典型增生患者,常用孕激素有安宫黄体酮(progesterone)、氯地孕酮(chloromadinone)、醋酸甲羟孕酮(medroxy progesterone acetate,MPA)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate,MA)等。安宫黄体酮口服10~12mg/d,或氯地孕酮口服2~4mg/d,或MPA口服100~200mg/d,或MA80mg/d,连续服用3个月,停药后刮宫,以子宫内膜病理学检查确定疗效。近年来,临床观察发现,对于孕激素治疗无效的子宫内膜不典型增生患者,米非司酮治疗往往能收到一定效果。常用米非司酮12.5~25mg/d,连续服用3个月,观察疗效。由于长时间服用米非司酮,可引起肝功能损害。因此,在米非司酮治疗中应注意肝功能变化。 (2)手术治疗:对于孕激素治疗无效的顽固性疾病或停药后复发者,应警惕癌变的可能,不要再盲目地继续孕激素治疗,应及时行手术治疗。手术治疗包括子宫内膜切除术、子宫切除术。对于有严重内科合并症而不能耐受手术者,可在宫腔镜下行子宫内膜切除术。术中应注意,内膜切除应全面,谨防遗漏,特别是双侧输卵管开口处内膜。此外还应注意内膜切除的厚度应达基底层,否则不能避免复发。术后患者应严密随访,曾有报道,宫腔镜下子宫内膜切除术后发生子宫内膜癌者。对于子宫内膜重度不典型增生患者,由于仅靠活检标本很难将其与子宫内膜高分化腺癌进行鉴别,甚至有时二者可以并存,因此宜行子宫切除术。 三、子宫内膜非典型增生的预后 子宫内膜癌前病变经保守治疗后均有复发的可能,特别是子宫内膜不典型增生患者,复发几率较高。据报道,高效醋酸甲羟孕酮治疗子宫内膜不典型增生,缓解率为83%,妊娠率为20%~30%,但妊娠后仍有75%的患者出现复发,10%~15%出现恶变。因此,子宫内膜癌前病变患者,保守治疗中及治疗后应密切随访,特别强调监测B超及定期诊刮术,以及早发现复发与恶变,以免延误治疗
宫颈上皮内瘤样病变变多见于育龄妇女。大量流行病学资料表明,初次性生活年龄过早、多个性伙伴、多产、有口服避孕药史及某些病毒感染等是宫颈上皮内瘤样病变的高危因素,其中与宫颈上皮内瘤样病变有关的病毒感染包括单纯疱疹病毒Ⅱ(HSV-Ⅱ)、HPV及HIV等,特别是HPV感染,是宫颈癌前病变及宫颈癌发生及发展的主要原因。 一、宫颈上皮内瘤样病变的病理特征 宫颈上皮不典型增生主要来源于宫颈柱状上皮下的储备细胞,由于受各种外界不良因素的影响,储备细胞出现不典型增生。1967年Richard将涉及宫颈上皮由正常、增生到癌变的一系列异常改变过程统称为宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN),用CIN分级来反映宫颈上皮异常的程度。根据不典型增生的程度及范围,可将宫颈上皮内瘤样病变分成CINⅠ级(轻度不典型增生)、CINⅡ级(中度不典型增生)、CINⅢ级(重度不典型增生及原位癌)。其中CINⅠ级是指核异质细胞(即细胞出现核染色质增粗、核质比率失常、有丝分裂指数增加等改变)累及鳞状上皮层下1/3;CINⅡ级是指核异质细胞累及鳞状上皮层下2/3;CINⅢ级是指上皮分层结构消失,细胞排列紊乱,极向消失,核异质细胞累及鳞状上皮层下超过2/3,但未达上皮全层;CINⅢ(原位癌)是指核异质细胞累及鳞状上皮全层,但基底膜仍保持完整。 二、宫颈上皮内瘤样病变的临床诊断与治疗 1.临床诊断:CIN患者的主要症状为阴道分泌物增多,有时伴有血性分泌物或接触性阴道出血。有些患者可出现不同程度的腰骶部酸痛或腹坠。子宫颈可呈不同程度的糜烂样、肥大、裂伤、外翻、息肉、半透明状囊泡等外观,病变局部较脆,触之易出血。有些患者宫颈光滑,仅在细胞学或组织学检查时发现异常。子宫颈上皮内瘤样病变的临床常用诊断方法有宫颈涂片细胞学检查、阴道镜检查、碘试验、宫颈活检及宫颈内膜诊刮术、宫颈锥形切除术等。其中宫颈锥形切除术适用于①宫颈细胞学检查与阴道镜下活检结果不一致,或宫颈细胞学检查、阴道镜检查与宫颈活检结果不一致;②宫颈活检发现有微小浸润癌;③可疑或不能除外浸润癌;④可疑宫颈腺鳞癌;⑤宫颈管内膜诊刮病理学检查异常或不满意。 2.治疗 (1)严密观察:CINⅠ是一种可逆性病变,自然消退率较高。其中65%病变可自然消退,20%持续存在,15%病变进展。因此,可以定期随访,严密观察,间隔3~6个月复查宫颈刮片。但由于CINⅠ患者中有10%可发展成CINⅡ和CINⅢ,约0.5%可进展为浸润性癌,所以需行阴道镜指导下的活检及颈管内膜诊刮术,以免误诊。 (2)局部药物治疗:可给予20%~40%硝酸银或50%三氯醋度或5%重铬酸钾或爱宝疗局部治疗。局部药物治疗具有无痛苦、治疗方便等特点,但所需反复治疗,疗程较长。 (3)物理治疗:物理治疗是临床最常应用的方法,具有无痛苦、见效快、疗效肯定、价格低廉等优点。常用物理治疗包括电凝治疗、冷冻治疗、激光治疗、微波治疗、射频治疗等。在物理治疗后1~2周内,因子宫颈水肿,阴道可排出大量水样白带,并伴有轻度腰腹坠痛。子宫颈新生上皮生长修复一般需要1~3月。在此期间内应禁性生活及盆浴,并用抗菌素预防感染。一般每月应复查一次。 (4)手术治疗:目前临床常用方法为宫颈锥形切除术、子宫切除术。宫颈锥形切除有传统的冷刀和环形电刀切除,二者对CINⅢ的有效率为87%~97%,但此种方法易发生局部出血及宫颈变形,对无子女者可因此而影响受孕及分娩。对于年龄大且无生育要求的患者,可直接行子宫切除术。 三、宫颈上皮内瘤样病变的预后 子宫颈上皮内瘤样病变可以自行消退或逆转、或持续不变、或病变进展为宫颈癌,其中多数CINⅠ级与 CINⅡ级病变可自然或经治疗后消退并恢复正常。CIN发展为原位癌的风险是正常的20倍,发展为宫颈浸润癌的风险是正常的7倍。CIN I、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ发展成为子宫颈癌的危险分别为15%、30%、45%,其中CIN I或CIN Ⅱ可不经过CIN Ⅲ阶段而直接进展为子宫颈浸润癌。因此,明确宫颈上皮内瘤样病变的自然病史和转归对患者的治疗和评价预后有着非常重要的意义。
外阴上皮内瘤变(VIN)和阴道上皮内瘤变(VAIN)都很少见,报道较少。VIN和VAIN常为多中心发生,与CIN相同,HPV感染是重要原因。所有的VINIII(93%检测到HPV-16DNA),所有VAIN(75%是HPV-16DNA)和96%的CIN(73%是HPV 16DNA)能检测到HPVDNA。 一、外阴及阴道上皮内瘤样病变的病理特征 近年来,外阴及阴道上皮内瘤样病变有年轻化和增多趋势。前者发病年龄为30~50岁,后者多见于60岁以上的妇女。外阴及阴道上皮内瘤样病变的病理特点是细胞不正常生长,细胞核深染、核异型性,细胞排列混乱、极向消失,核分裂相多见,DNA核型为非二倍体。 二、外阴及阴道上皮内瘤样病变的临床诊断与治疗 1.临床诊断:外阴及阴道上皮内瘤样病变多无特异性症状。外阴上皮内瘤样病变患者主要表现为外阴瘙痒、烧灼感、外阴皮损、溃疡、丘疹、斑点或赘疣等。阴道上皮内瘤样病变可有阴道分泌物增多、或接触后阴道出血等。诊断需依靠局部病灶活检病理检查,对可疑部位应行多点活检,取材应注意深度。阴道镜下定位取材有助于提高病理诊断的准确性。 2.治疗 (1)观察:适用于VINI或VAINI、年轻、无症状、有随访条件或妊娠时。如果观察期间病变加重,或观察6~12月仍无改善,应予处理。 (2)药物治疗:常用5FU局部治疗。 (3)物理治疗:对早期病变可采用CO2激光、冷冻和LEEP、高能聚焦超声刀等治疗方法。 (4)手术治疗:手术切除病灶是主要治疗方法,根据病变情况,可行病灶局部广泛切除、剥皮式外阴切除和单纯外阴切除。手术既要考虑病灶彻底切除,又要考虑重建外阴或阴道以恢复正常性生活。 三、外阴及阴道上皮内瘤样病变的预后 VIN和VAIN恶变过程是缓慢的,常发生退变。VAIN随诊3年,9%进展为浸润癌,13%病变持续,78%退化。值得注意的是,VINIII中2%~8%可能合并浸润瘤。VINIII常合并多灶隐性外阴癌,如手术边缘未净,复发危险增加3倍。