首都儿科研究所附属儿童医院遗传室科普号

16p11.2微缺失综合征 原文作者：WendyKChung1,TimothyPLRoberts2,ElliottHSherr3,LeeAnneGreenSnyder4andJohnESpiro51DepartmentsofPediatricsandMedicine,ColumbiaUniversity,NewYork,NY,SimonsFoundation,NewYork,NY,UnitedStates2LurieFamilyFoundationsMEGImagingCenter,Dept.ofRadiology,Children’sHospitalofPhiladelphia,Philadelphia,PA19104,UnitedStates3DepartmentofNeurology,WeillInstituteofNeurosciences,UniversityofCalifornia,SanFrancisco,UnitedStates4SimonsFoundation,160FifthAvenue,NewYork,NY10010,UnitedStates 翻译：刘芳1，陈晓丽21国际和平妇幼保健院中心实验室，上海2首都儿科研究所遗传研究室，北京 【摘要】16p11.2微缺失（BP4-BP5区域）是长度约600kb的再发性拷贝数变异，该微缺失是神经发育障碍和自闭症谱系障碍最常见的病因之一，发生率约为1/2000。16p11.2微缺失携带者早期神经发育迟缓，具体来说，70%的携带者会言语、语音、语言受损。智商比正常人低1.8个标准差。其他常见的神经行为障碍包括运动协调困难(60%)和自闭症(20-25%)。无明显诱因的癫痫发作很常见(24%)，多易于治疗或者随着时间自愈。肥胖贯穿携带者整个童年，到成年时，75%的人都是肥胖的。先天畸形比一般人群中更为常见。该微缺失与大脑全区域的脑容量增加、脑白质微观结构改变以及听觉皮层的早期电生理反应改变有关。对特定遗传变异的研究，尤其是与严重畸形无关的拷贝数变异(CNVs)，为研究基因变异对大脑发育、结构和功能的影响提供了共通性，从而更好地理解复杂的神经行为表型（如自闭症）。 【前言】16p11.2区域（BP4-BP5）两端都存在约147kb高度同源低拷贝重复序列，该区域缺失（大约600kb）是神经发育障碍最常见的病因之一。在一般人群中16p11.2微缺失和微重复的发生率分别约为1/2000和1/1100。虽然我们将简要地和16p11.2微重复携带者的特征进行比较和对比，但本文的大部分内容将集中在16p11.2微缺失携带者。该微缺失通常是新生的，其中大约7%为遗传性的。该微缺失是孤独症谱系障碍(ASD)最常见的遗传病因之一(0.5%)。为了更好地理解16p11.2微缺失对大脑结构、认知和行为上的影响，Simons基金会创建了SimonsVariationinIndividualsProjectVIP联盟，招募和研究了大量的该微缺失携带者，并将这个数据与一个类似的欧洲联盟相结合。 SimonsVIP项目于2010年启动，由SFARI资助，该项目基于“遗传学优先”的策略来探索不同基因变异致ASD的共通性，招募并研究了大量携带相同具有高外显率的拷贝数变异/单基因变异的个体。招募时不考虑临床诊断。一个关键的目标是纵向研究临床表型，并评估遗传病因之间对临床表型影响的相似性和差异性。项目的第一阶段集中于对16p11.2微缺失和微重复携带者进行直接、详细的表型分析。临床诊断来源于互联网搜索，临床测试实验室和医生。在携带者家庭中还进行级联测试鉴定出其他的携带者来解决临床诊断偏倚。对那些不使用镇静剂也能合作的个体进行评估，评估内容包括神经学评估、心理测试和大脑结构成像。一部分携带者进行了详细的功能成像(fMRI)和MEG检查。这些数据还是与欧洲16p11.2队列进行了联合分析，该欧洲队列由转诊医生招募。该项目的第二阶段已被重新命名为“SimonsSearchlight”，旨在通过将招募转变为远程在线、电话护理人员报告和医疗记录审查来大大扩大队列规模和特定研究状态的数量。一小部分个体的血液储存在一个中央储存库中，该项目利用这些血样构建iPSC并将其分发到研究实验室。重要的是，该队列是可再联系的，研究人员可以请求访问179个个体的其他问题。 【医学特征】16p11.2微缺失的影响体质特征。虽然16p11.2微缺失携带者出生时头围较小，但2岁时头围整体增加，17%的携带者出现大头畸形。通常在儿童时期出现肥胖和身体质量指数(BMI)上升。出生时体重低于平均水平，10岁时BMI的Z值显著高于平均水平。纵向数据显示，BMI的这种增长可以是突然而剧烈的。在成人中，75%的个体是肥胖的，而在所有的成人肥胖患者中，45%的人是病态肥胖，与过度饮食有关。超过一半的微缺失携带者有畸形或主要的医疗问题，大多数只有一个医疗问题，尽管大多数被研究的个体是儿童或年轻人。未观察到具体的顺序发病的或者全身受累的复发性畸形，因此16p11.2微缺失不应主要被视为畸形综合征。罕见的畸形包括脑皮质畸形、颅缝早闭、缺损、小眼症、尿道下裂、隐睾、膀胱输尿管反流、幽门狭窄、先天性心脏病和腭裂/腭咽功能不全。最常见的异常是椎体异常(半椎体或脊柱后凸影响20%的携带者)。一半的携带者都有面部畸形，但面部特征不明显，也不容易识别。 【行为特征】16p11.2微缺失儿童的神经行为特征主要是普遍的言语和语言障碍(>70%)和运动协调困难(60%)，其他还包括学习和智力障碍(20%)、孤独症(20-25%)和其他行为/精神问题(在少数个体中观察到)。16p11.2微缺失携带者的全量表智商(FSIQ)比非携带者的兄弟姐妹和父母低1.8个标准差。16p11.2微缺失的影响表现为特定的言语、语音和语言障碍以及智力障碍。随着年龄的增长，携带该微缺失的幼儿在语言能力上有所提高，在运动协调和社交技能上存在持续的迟缓和缺陷，这需要持续的支持。对语言的详细研究表明，16p11.2缺失与儿童言语失用症(77%的儿童、一半的成人)、发音缺陷和临床构音障碍密切相关。此外，语言产生障碍(包括语法和更高层次的语言语用)会持续存在，甚至在控制ASD和认知障碍后仍然存在。在行为和精神问题方面，最近的一份来自U.K.IMAGINE-ID研究报告证实了16p11.2微缺失具有广泛的神经行为特征，最常见的特征与多动症和ASD有关。与ECHO和欧洲16p11.2联合队列的数据一起分析，抑制解除行为、注意缺陷多动障碍(ADHD)和ASD仍是最常见的(20-25%)行为特征。即使在没有被诊断为孤独症的儿童身上，重复行为和较差的社交技能也是普遍存在的，并导致社会反应性量表得分显著区别于兄弟姐妹和父母。然而，早期关于精神分裂症风险的担忧并没有在最近的研究中得到证实。 【神经特征】我们对136名微缺失携带者进行了全面的病历回顾和儿童神经科医生的亲自检查，确定了微缺失携带者的特征包括对称性张力减退(50%)、异常敏捷或笨拙(47%)、震颤(相当于原发性震颤-25%)和反射/阵挛增加(13%)。34%的患者有骶部小凹，但影像学检查时无相关的脊髓栓系。最开始研究中显示22%的携带者发生无诱因癫痫发作，一项更全面的癫痫研究发现，在129名16p11.2微缺失患者中，24%的个体至少有一次癫痫发作，其中21人(16%)继续出现复发性无诱因癫痫发作。近一半的癫痫患者可被归类为良性婴儿癫痫(可能是由于PRRT2基因缺失)。大多数癫痫患者的癫痫发作得到很好的控制或长大后不再发作，只有少数患者为难治性癫痫。                             【16p11.2微缺失和微重复携带者的脑成像比较】一套全面的神经成像技术(磁共振成像(MRI)和脑磁图(MEG))被用来评估大脑的结构和功能差异。16p11.2微缺失与脑结构体积(以及脑总大小和颅内体积，ICV)的增加相关。除了研究高功能16p11.2微缺失携带者的成像外，基于临床损伤范围越大，我们就能够检测到更大范围的结构/功能改变的假设，我们还对脑MRIs进行了集中评估。事实上，我们发现与对照组相比，16p11.2微缺失携带者的胼胝体更厚，30%的缺失携带者有小脑扁桃体异位，9%有ChiariI型畸形。在对遗传背景不知情的情况下，神经放射学家评估发现胼胝体较厚与这些携带者的适应性行为评估得分相关(p<0.003)。当考虑由磁共振弥散张量成像(DTI)获得的脑白质微观结构特征时，16p11.2微缺失与弥散“各向异性分数”的广泛增加有关，这表明非典型白质成熟，与大脑连接和大规模网络功能有关。在脑磁图研究中（以毫秒尺度评估神经功能），与年龄匹配的对照组相比，16p11.2微缺失携带者的听觉皮层早期皮质反应(特别是100毫秒的“M100”反应)延迟20毫秒。这种延迟是由于听觉通路(从耳朵到脑干到皮质)的传播受损，还是与皮质-皮质延迟有关，目前尚不清楚。同样，这种延迟是否归因于白质传导与突触传递仍未解决。最后，16p11.2微缺失携带者的听觉混合磁场(MMF)延迟。有趣的是，这些延迟与一般认知(非语言智商)和语言基础临床评估量表(CELF-5)临床评估相关。因此，结构和显微结构成像以及早期电生理反应对基因剂量表现出敏感性，MMF延迟与临床表现和行为表型的相关性。 【16p11.2微缺失和微重复携带者的比较】16p11.2微重复的携带者相对普遍，并且76%为遗传性的。将16p11.2微缺失和微重复携带者进行比较为研究基因剂量效应提供了极好的机会。与微缺失携带者相比，微重复携带者临床表型较轻。通过认知和行为的标准化测量以及对医疗记录的回顾显示从基于人群的筛查或级联试验中确定的许多微重复携带者是神经正常的。与微缺失携带者头围增大相对应，微重复携带者的头围减小。大脑MRI也显示这种“镜像”关联，微缺失携带者脑容量增大，微重复携带者脑容量减小。16p11.2微缺失携带者的DTI改变与微重复携带者的发现直接相反，呼应了脑结构的发现，再次提示基因剂量对脑白质微观结构性质的影响，并最终影响脑结构连接。在评估早期皮质反应时，在微缺失携带者中观察到M100反应延迟，在16p11.2微重复携带者中未发现。考虑到有证据表明这种听觉皮层诱发的反应潜伏期与听觉通路白质的微观结构特性有关，这可能并不令人惊讶。最后，与上述在结构和微观结构成像以及早期电生理反应中观察到的相反效应相比，听觉混合磁场(MMF)延迟在16p11.2微缺失和微重复携带者中均显示延迟。基因剂量对大脑结构和功能的主要和次要影响的研究只有通过对具有可比性的微缺失和微重复携带者并行应用全面和详细的方法才能实现。 【是什么导致了微缺失携带者的表型异质性?】16p11.2微缺失携带者存在显著的表型异质性，但其原因尚不清楚；一些初步的研究表明围产期并发症和携带其他CNVs可能是表型特征更严重的因素。基因组的其他部分罕见和常见变异也影响这些医学和神经行为表型。随着时间的推移，更完整的基因组特征和对基因组的理解可能会让我们确定一些额外的发挥作用的因素。16p11.2微缺失与一些非特异性表型相关，外显率问题经常被提出。每个个体的相关特征(头围大小、脑容量、ASD、智力障碍、语言和协调障碍、癫痫、肥胖或先天畸形)的外显率与年龄有关。然而，重要的是也要考虑到微缺失如何改变数量性状的分布：作为一个群体，平均而言，微缺失携带者智商比父母的智商下降了1.7个标准差，头围增加了0.6个标准差，尽管有个别例外。对于离散型的表型，如先天畸形，大多数这些畸形是罕见的，提示其要么是偶然的关联，要么是低外显率。我们评估了SimonsVIP队列的原始数据旨在发现该区域可能的隐性变异，但我们没有发现。在该区间内的29个基因中，有3个基因(MAZ,TAOK2和CORO1A)对功能丧失具有剂量敏感性(pLI为>0.9)，可能会是影响表型的主要因素。该区域内TBX6基因是椎体畸形的候选基因，因为它与常染色体显性和隐性脊柱畸形5(OMIM#122600)有关，Tbx6纯合突变的小鼠显示肋骨和椎体异常。PRRT2基因突变已在癫痫和阵发性运动障碍(OMIM#128200,602066,605751)患者中被发现。在一个三代家族中，包含MVP、CDIPT、SEZ6L2、ASPHD1和KCTD13基因的118kb缺失与ASD和其他神经发育异常表型分离，但不与癫痫表型分离。在斑马鱼中减少KCTD13同源基因的表达会导致巨头畸形，而在小鼠中敲除KCTD13同源基因会导致细胞增殖增加。 【展望】随着临床染色体微阵列技术在产前和儿科（适应症包括先天畸形、发育迟缓/智力障碍、孤独症和癫痫）应用的增加，拷贝数变异（包括16p11.2微缺失）的诊断增加。个体被诊断得更早，甚至是在产前，这为包括自闭症谱系障碍在内的神经行为疾病的早期干预、癫痫的早期识别和治疗、甚至控制体重提供了机会。临床研究协会(ClinicalResearchAssociates)将很快启动一项使用arbaclofen治疗16p11.2微缺失的临床试验，该试验部分基于3种不同背景的16p11.2小鼠模型(同源7qF3区域）表明在许多情况下，arbaclofen有使小鼠自发野外活动以及情境性恐惧记忆缺陷正常化的作用。通过这项试验和其他试验，我们将测试基于遗传学优先策略开发ASD和相关神经发育障碍治疗方法的能力。我们正在继续扩大16p11.2微缺失和微重复携带者的队列，并随时间纵向追踪。为了增加参与研究的机会，通过远程在线和电话采访收集数据。我们正在探索更多的方法来收集在线表型数据，并在家庭环境中使用可穿戴设备和传感器来收集更自然的行为定量数据，包括睡眠，这可能会提供对大脑和行为的洞察。对于能够提供详细的纵向的神经心理测试和神经影像学数据的微缺失和重复的个体进行更同质的研究，能够为了解基因对大脑结构和功能以及复杂的人类行为的主要和次要影响提供了宝贵的机会。大量的个体是必要的，以有力地解释结果，并支持研究相对常见的遗传变异对表型的影响的策略。如果能够评估足够数量具有相同拷贝数变异的个体，就有可能研究其他因素（遗传、家庭、环境和/或发育）对携带相同CNV个体表型的复杂性和异质性的贡献。 

生活大爆炸第四季里有一集，Sheldon曾经跟Leonard探讨过一个问题，他怀疑自己有先天性巨结肠。很多好奇宝宝或者喜欢刨根问底的理科生可能都会想到一个问题：通常我们说的“遗传病”不是应该有家族史的吗？如果一个人的爸爸、妈妈都是正常人，为什么后代会得病呢？这种表面上根本看不出来“遗传”迹象和“遗传”来源的疾病，为什么会是遗传病呢？今天就努力给大家讲讲这个病的“前世今生”。1888年一位丹麦儿科医生在世界上首次发现并且报道了先天性巨结肠的临床症状，这个病此后就用他的名字命名为：Hirschsprung’s disease（简称HSCR）。在1940年人们明确了疾病的病理改变以及上世纪50、60年代逐渐发展出不同手术方法来治疗、解决肠道梗阻的问题以来，先天性巨结肠的致死性变得不那么严重了。但是随之而来的，是很多“幸存”下来的患者有机会把他们携带的基因突变遗传给下一代，从而导致了越来越多的“家族性”患者的出现。以此为契机，研究者很快于1993年定位出该病的第一个致病基因：RET，并陆续发现RET、EDNRB基因相互作用在肠神经系统发育中的重要作用以及RET基因内含子中的单核苷酸多态性变异可以显著增高患病风险等。诸多研究结果都证实：先天性巨结肠的发生与一个个体的“遗传背景”（genetic background）密不可分，“遗传”因素对于疾病发生的贡献大概可以达到80%左右。OK，那么问题来了，为什么我们身边的HSCR患者属于家族性的并不多（即每个家庭只有一个患者），甚至有好多患者他们的父母都是正常（没有临床表现）的呢？这就要从HSCR这个疾病的复杂性和中国的特殊国情说起了。首先，HSCR属于典型的人类复杂疾病，即使是疾病的主要基因RET，也只能解释约50%家族性HSCR患者和10-35%的散发病例的发病原因，并且RET基因参与HSCR的发生还有4个特性：（1）编码区的罕见变异在整个基因范围内散在分布，不存在热点区域或热点位点，因而给拟诊或确诊患者的基因检测带来了困难；（2）不同类型突变的外显率差异很大，家族内遗传方式常常不遵循经典的孟德尔遗传规律，不易建立明确的基因型-表型相关性，因此给遗传咨询乃至产前诊断的实施设置了几乎难以逾越的鸿沟；（3）作用机制复杂-HSCR患者携带的突变多数都是功能失活突变并由此导致肠神经嵴细胞（Enteric Neural Crest Cell, ENCC）出现迁移、增殖或分化缺陷，而同一基因的功能获得突变却可引起IIA、IIB型多发性内分泌肿瘤或遗传性甲状腺髓样癌，既往文献报道及我们在临床工作中都遇到过家系内不同成员携带相同突变但是表型却有很大差异的实例；（4）亚效等位基因的存在-内含子及上游非编码区内有多个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）位点，以增强子的角色参与基因表达水平调控，并能解释更多患者（尤其是最常见的短段型、男性患者）患病风险显著增加的原因。以上四条概括起来，大概可以通俗解释成三点：一、患者父母可能临床表现较轻，因此没有就医、确诊为HSCR；二、患者的主要致病突变有可能确实遗传自父母一方，但由于同一突变在不同个体的“外显”程度（可以简单理解成表现度）不同，有可能被忽视；三、RET基因的功能除了受一些罕见突变的影响外，还有很多其他调控因素，患者可能从父母双方分别获得了风险变异位点，两者或多者“叠加”最终导致了疾病的发生。其次，中国的独生子女政策可能在某种程度上大大降低或者切断了家族性患者的出现概率，因此我们推测，随着“全面二孩”时代的来临，或许3-5年内就可以观察到先天性巨结肠的一个“井喷”现象。目前分子遗传学家的共识是：RET基因功能异常是HSCR发生的必要条件，几乎每个患者，都一定有这个基因的功能下降，原因可能是罕见突变，也可能是SNP导致的基因转录水平受损。今天先来说说前者：依据美国医学遗传学与基因组学学会（The American Collegeof Medical Genetics and Genomics, ACMG）制定的序列变异解读指南，我们可以对RET基因上发现的罕见突变的致病性进行大致划分如下：（1）致病性变异-证据等级：非常强：先天性巨结肠（HSCR）的主要发病机制为RET基因及其编码蛋白的功能缺失（loss-of-function, LOF），在此情况下，下列几种无功能变异应被视为证据非常强的致病性变异：无义突变、移码突变、经典±1或±2的剪接突变、起始密码子变异、单个或多个外显子缺失。（2）致病性变异-证据等级：强：包括与已知的致病性变异有相同的氨基酸改变（错义突变）、患者自身的新发变异且无家族史、体内外功能实验已明确会导致基因功能受损的变异、变异出现在HSCR群体中的频率显著高于对照群体等。（3）致病性变异-证据等级：中等：包括：位于关键蛋白功能域的变异、数据库显示正常人未发现的变异（或极低频位点）、在非重复区内的非移码插入/缺失、终止密码子丢失、已知致病位点发生的未报到过的错义突变、由于父母一方或双方DNA样本缺失导致的无法验证的新发变异等。（4）致病性变异-证据等级：支持：包括：在家系内的多个患者都可检测到的变异、多种统计方法均预测会对基因或基因产物造成有害影响的变异等。（5）文献报道过的可能致病变异举例：有些文献曾经报道过很多在HSCR患者检查出来的突变（或变异），这些突变（或变异）如果有进行过相应的功能学实验并且证实可以影响RET编码蛋白质的功能，它的致病性就基本可以确立；如果是没有功能实验但是在多个不同种族或者同种族不相关的患者内被检出过，致病的可能性也是比较大的。所以我们在评判一个变异的致病性时，通常要考虑很多方面的因素，而且有些情况下确实没办法给出一个100%确定的结论，这是复杂疾病研究的共性。摘自参考文献：Hum Mutat. 1997, 9 (3): 243-249, SeriM et al (Frequency of RET mutations in long- and short-segment Hirschsprungdisease)摘自参考文献：J Hum Genet. 2012,57 (8): 485-493,Carter TC et al. Hirschsprung's disease and variants in genes that regulateenteric neural crest cell proliferation, migration and differentiation.摘自参考文献：Trends Genet. 2001, 17 (10): 580-589,Manié S et al. The RET receptor: function in development and dysfunction incongenital malformation.框内突变部分降低RET激酶活性。总的规律：①胞外段的突变可能影响RET蛋白质成熟和细胞膜表面的表达；②半胱氨酸富集区的突变可能会影响蛋白质二聚体的共价结合和转运；③酪氨酸激酶功能区的突变可能会改变酶的催化活性或影响蛋白质的结构稳定；④胞内段的突变可能会影响受体与细胞内信号蛋白的结合。文末划重点：（1）如果你的主治大夫告诉你先天性巨结肠是不遗传的，再生育时可以完全不用考虑再发风险，那么你可能已经开启了一段“无知者无畏”的旅程；（2）对于严重类型的HSCR患者，即长段型和全结肠受累型，我们强烈建议家长给孩子进行相关基因检测，因为发现致病基因突变的几率相对较大，而明确的分子遗传学诊断是遗传咨询的必要、先决条件。

对于平均人群发病率只有大约五千分之一（1/5,000）的一个疾病来说，很多人确实一辈子也不会知道“先天性巨结肠”这个名字。在我们每年接诊的一百多个家庭中，家长们接二连三地提出的众多问题中排名第一的几乎都是：为什么我的孩子会得这个病？！ “新世纪”的第一更，就用我们最近整理、发表的一篇文章中的数据试着给大家剖析一下这个狡猾的“对手”的隐藏路径。 下图是我们2019年接诊过的第一个家庭，很奇怪，患者的妈妈先后两次结婚，后代一男一女（患者1及患者2）都出现了严重的先天性肠道发育异常。具体来说，就是新生儿的整个肠道（从小肠到大肠）内都没有神经节细胞，导致平滑肌不能正常舒张、肠管处于异常缩窄状态，吃的、喝的东西不能正常通过，于是患儿在生后很快就出现了严重且迅速发展的肠梗阻并最终危及生命。在了解病史的过程中，我们首先排除了孩子父母近亲结婚的情况（比如我爸爸是你舅，或者我的姑姑跟你的姥姥是亲姐妹，诸如此类吧~），然后也确定了双方都不存在家族史的事实（意即患儿的妈妈和爸爸各自的家庭中都没有亲属有过类似的病史或症状）。此后的遗传学检测发现妈妈在先天性巨结肠已知的致病基因RET内携带一个自发的罕见突变（代码是c.1879+1 G>A）并且遗传给了她的女儿（患者2），这个突变在她本人的父亲、母亲、大姐、二姐和弟弟中都没有检测到，也就是我们通常所说的很可能是在胚胎发育过程中自发产生的。很不幸，对吧~ 但是她本人却没有任何明显的临床症状！为了探究原因，我们对这个三口之家的已知RET风险单体型进行了检测，证实妈妈的两条等位基因都是“G-T-C”这种较为“温和”的单体型，这种单体型的组合本身不会对RET基因的转录产生明显影响。也就是说，妈妈本人的自发突变整体上讲没有严重“打击”到基因的正常功能，所以一直没有被发现。相比之下，患者妈妈的第二任丈夫的2条等位基因中，1条是“G-T-C”这种较为“温和”的单体型，但另外1条是“G-T-T”这种会明显降低RET基因的转录水平的“风险”单体型，并且在掷硬币二选一的时候把这条功能差一些的等位基因遗传给了他的女儿：1个来自妈妈的罕见自发突变（c.1879+1 G>A）把一半的功能损坏掉，再加上1个来自爸爸的“风险”单体型（简称为G-T-T）把另外百分之五十的功能也干掉一部分，这样“双剑合璧”，就把患者2推向了万劫不复的深渊。 第二个家庭中，我们也有类似的发现：患者的爸爸在先天性巨结肠已知的致病基因RET内携带一个自发的罕见突变（代码是c.2607+5 G>A）并且遗传给了他的儿子（患者），这个突变在他本人的父亲、母亲、哥哥和姐姐中都没有检测到。患者的妈妈的2条等位基因中，1条是“G-T-C”这种较为“温和”的单体型，但另外1条是“G-T-T”这种会明显降低RET基因的转录水平的“风险”单体型，并最终把功能差一些的等位基因遗传给了她的儿子：1个来自爸爸的罕见自发突变（c.2607+5 G>A）把几乎一半的功能损坏掉，再加上1个来自妈妈的“风险”单体型（G-T-T）把另外百分之五十的功能也干掉一部分，就这样最终夺去了这个孩子的宝贵生命。 下面用一个模式图总结一下今天的“烧脑”小课堂：嘴巴呈“-”形的笑脸代表这条RET等位基因的功能基本正常；嘴巴呈上弧形的哭脸代表这条等位基因的功能较差。如果2条等位基因中有1个笑脸、1个哭脸，那么整体功能还能维持；但是2个哭脸凑在一起，那就是“大凶”之相了。 在后续的研究中，我们证实“G-T-T”这种“风险”单体型在中国人群中的携带率其实并不低：大约有60%的汉族人都携带至少一个拷贝，有将近10%的（极端）汉族人甚至携带2个拷贝。也就是说，RET基因的“风险”单体型具有挺广泛的“群众基础”，功能略有缺陷的这些个体就散布在芸芸众生中。当他们/她们与携带自发突变、但由于功能没有严重受损而同样没有任何表现的另一半结合并生育下一代的时候，这个“假面舞会”的游戏很可能就“玩”不下去了。 请扫码关注微信公众号：“先天性巨结肠的遗传与科普”，把您的困惑和疑问留言告诉我们。

先天性巨结肠患者（红色）和正常对照者（黑色）的卡普兰-迈耶生存曲线图从上个世纪五、六十年代外科手术治疗方式发展起来以后，先天性巨结肠患者的死亡率有了明显下降。但是由于初诊患者（尤其是临床类型比较严重的长段型或全结肠型者）的年龄往往较小、病情变化迅速，临床上因肠坏死、菌血症、巨结肠危象、休克等造成的死亡病例仍然时有出现。除此以外，很多家长最焦虑的问题之一就是：“这个病的长期预后怎么样？我的孩子以后会不会出现新问题？究竟他能不能正常长大成人？”。目前由于我国的新生儿登记、追踪系统尚不完善，对于这个问题我们没有办法回答。但是国际上其他国家的流行病学数据或许可以给我们提供一些很有价值的信息：2017年11月，《国际小儿外科》杂志正式发表了瑞典研究者的分析报告，1964到2013年间在瑞典一共有739人被诊断为先天性巨结肠，其中男性565例，占比达到76%。研究者共纳入了7390名性别和年龄都与之相匹配的正常人进行对比，结果发现：巨结肠患者中共有22人死亡（死亡率为3%），死亡的中位年龄为2岁半（介于0-35岁之间）；而正常人中死亡者人数为49（死亡率为0.7%），中位年龄20岁（介于0-44岁之间），两组间有显著差异（P< 0.001）。患者的死亡风险比（hazard ratio）为正常人的4.77倍，即使刨除掉21-三体后仍高达3.6，最常见的死因分别是感染、先天性巨结肠疾病本身及先天畸形。下面这个表格列出了全部22名患者的具体死亡年龄及原因：参考文献：Lf Granstrm A, Wester T. Mortality inSwedish patients with Hirschsprung disease. Pediatr Surg Int. 2017 Nov; 33(11):1177-1181.文末划重点：瑞典研究人员的报告显示先天性巨结肠患者的死亡率约为3%，中位年龄2岁半。21-三体、全结肠型巨结肠、巨结肠相关小肠结肠炎都会显著增加患者的死亡率。生后第一年是关键期，应予以高度重视。请扫码关注微信公众号：“先天性巨结肠的遗传与科普”，把您的困惑和疑问留言告诉我们。

上篇文章里给大家介绍了RET基因中的罕见变异在先天性巨结肠发生中的作用，今天我们来说说这个基因上的几个snp（单核苷酸多态性）干的“坏事”。之前我们说过，在HSCR患者发现过的致病性编码区变异几乎没有什么热点，且总体来说都非常罕见，以至于很多家庭都是以单例模式（singleton）的情形存在的，即不易看到两个或两个以上的不相关家系患者携带相同突变的现象。与此相对，RET基因内含子及5’非编码区中的几个snp所对应的疾病相关等位基因（或称风险等位基因，riskallele）却在普通人群中普遍存在，尤其是亚洲人~你有，我有，全都有啊！2005年Aravinda Chakravarti教授及其实验室首先确认了rs2435357（snp的编号名称，相关信息统一收录在dbSNP数据库里）与HSCR的相关性，他们发现欧洲正常人群和HSCR患者人群中该snp风险等位基因T的频率分别是25%和58%，携带风险等位基因时疾病患病风险最多可高于正常人4.1倍（P值为3.31×10-50）。从下图中我们可以看出，包括中国在内的亚洲人群中T等位基因（图中每个小圆圈的黄色部分）的频率要远高于欧洲、非洲等其他种族。参考文献：Nature.2005,434(7035):857-863.A common sex-dependent mutation in a RET enhancer underliesHirschsprung disease risk.接下来在2016年，Chakravarti教授团队再次发现并证实了RET基因上游非编码区内的另外2个snp的疾病相关性：rs2506030-参考等位基因：A；疾病相关等位基因（风险等位基因）：G。欧洲正常人群和HSCR患者人群中该snp风险等位基因的频率分别是41%和56%，携带风险等位基因时疾病患病风险最多可高于正常人1.8倍（P值为4.46×10-11）；rs7069590-参考等位基因：C；疾病相关等位基因（风险等位基因）：T。欧洲正常人群和HSCR患者人群中该snp风险等位基因的频率分别是76%和84%，携带风险等位基因时疾病患病风险最多可高于正常人1.7倍（P值为4.36×10-6）。通过迄今为止最大样本量的基因型分析，目前遗传学家得出的结论是：RET基因非编码区的3个snp的疾病相关等位基因可以显著增加先天性巨结肠（HSCR）的患病风险。几乎每个HSCR患者都至少携带一条风险等位基因。每个受检样本在上述3个snp至多可以携带6条风险等位基因（即rs2435357、rs2506030、rs7069590的基因型分别是TT、GG、TT），至少携带0条风险等位基因（即rs2435357、rs2506030、rs7069590的基因型分别是CC、AA、CC）。累积携带的风险等位基因数目越多，患病风险越高。Chatterjee等人对346例患者和732例正常人进行的单体型分析结果显示，“TGT”单体型和“TAT”单体型比“CAC”单体型的患病风险分别高4.4倍（置信区间：3.26-5.94，P值为3.62×10-22）、3.1倍（置信区间：2.17-4.5，P值为3.62×10-10）。体外实验也证实这两种单体型确实会显著降低增强子的活性，从而使基因表达量显著减少。参考文献：Cell.2016,167(2):355-368.EnhancerVariants Synergistically Drive Dysfunction of a Gene Regulatory Network InHirschsprung Disease.如果某个样本在这三个snp上的累积风险等位基因数目较多，或者一条乃至两条等位基因上的单体型属于风险型（即rs2435357、rs7069590均为“T”，或rs2435357、rs7069590、rs2506030为“T”、“T”、“G”），那么其RET基因编码蛋白质的功能就可能会严重受损，以至于影响胚胎期肠神经系统的正常发育~《非诚勿扰》片尾曲说“向前一步是天堂”，但是在RET，真的是多一个risk allele就可能迈向地狱啊！q中国HSCR患者种族特异性的单体型：科学家发现RET基因编码区内的3个同义变异（p.A45A、p.A432A、p.L769L）组成的单体型为中国HSCR患者所特有的，A(c.135G>A,A45A)+G(c.1296G>A,A432A)+G(c.2307T>G,L769L)(A-G-G,x2=22.23;P值为0.000002)在患者中的比例（检出率）可高达66%。注意：A-G-G单体型主要见于短段型HSCR患者，而A-A-G则多见于长段型HSCR患者（参考文献：J Med Genet.2003,40(11):e122,Garcia-BarcelóMM et al）。这一奠基者效应（founder effect）的存在也从一个侧面有力地说明先天性巨结肠应属于遗传病无疑。文末划重点：与编码区罕见变异相比，RET基因3个snp上的疾病相关等位基因（风险等位基因）在人群中普遍存在，且存在协同作用关系。它们就像是金字塔的基座，把某些个体推离人群，当基因功能受损程度达到甚至超过一定阈值时，就会显现出临床症状。因此在给单纯型先天性巨结肠患者进行基因检测时，最好能够兼顾。请扫码关注我们，留言说明您感兴趣的话题并索取一对一的咨询服务^_^

很多家长都问过我一个同样的问题：怀孕期间应该注意些什么？怎么能避免孩子得先天性巨结肠？今天就给大家讲讲目前研究得比较明确的环境风险因素，希望能引起相关家庭的重视。首先，我们要强调，遗传因素仍然是先天性巨结肠（HSCR）的主导因素，尤其是对于家族性患者来说。如果您的宝宝罹患的是属于比较严重的巨结肠类型（即长段型或者全结肠型）而且家里有不止1个患者，我们还是强烈建议家长考虑进行相关候选基因的检测，以尽可能的找出疾病背后的严重突变和“遗传背景”。至于非遗传因素，也就是通常泛指的“环境因素”，近年来也有很多学者在进行研究并且得出了一些初步结论。但可能因为HSCR的发生率实在太低了，除非是像本文下面要介绍的这种大规模、国家范围（甚至是洲际范围）、有完善规范登记制度作保障的基于庞大样本的人群研究，实际操作中是很难从众多的混杂因素中发现、剥离出真正疾病相关的危险因素的。言归正传，赶紧来看看2017年6月刚刚发表在OrphanetJournal of Rare Diseases杂志上的这篇文献都做了什么、说了什么：作者回顾、分析了1996年1月至2016年3月在丹麦出生的全部1,256,317名新生儿及其母亲的个人情况，结果发现，怀孕早期使用第二代抗抑郁药-选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptakeinhibitors, SSRI）可以显著增加后代HSCR的患病风险。SSRI是近年来广泛使用的处方类抗抑郁药，通过抑制5-羟色胺重摄取进入突触前细胞而增加突触间隙5-羟色胺的水平，代表药物如我们所熟知的百优解（氟西汀）等。文中对于怀孕早期的定义是受孕前30天至怀孕后第12周。19807名新生儿的母亲在这个时期有过SSRI药物暴露（服用）历史，其HSCR发生率为0.08%（16/19807）；相比之下，1236510名母亲没有SSRI暴露史的新生儿中HSCR的发生率为0.05%（584/1236510）：总体患病风险（OR值）为1.76。如果对SSRI类药物使用频次进行进一步划分，可以看出，孕早期分别使用过至少一次或者至少两次SSRI者的后代发生HSCR的风险分别是从未使用者的1.33倍和2.34倍，说明一定程度上这类药物存在剂量依赖效应。除此以外，作者还在文章结尾处对至今为止的几个大的人群样本研究结论进行了小结：母亲吸烟可能与后代胃肠道畸形的发生有关，但是其与HSCR之间的关系尚不明确。维生素A缺乏（或营养缺乏、失衡）可以影响甚至破坏小鼠的肠神经系统发育，引起与人类HSCR类似的症状。最后，母亲肥胖（BMI指数显著超标）可能增加后代HSCR的发生率。想了解详情的可以戳这里阅读原文：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Maternal+use+of+selective+serotonin+reuptake+inhibitors+during+pregnancy+is+associated+with+Hirschsprung%E2%80%99s+disease感兴趣的家长请扫码参与我们的问卷调查，希望能尽快明确中国先天性巨结肠的发生是否有特殊的环境风险因素，以便为降低出生缺陷率和更准确的遗传咨询提供相关信息。