双腔管单肺通气用于肺叶切除手术导致肺血流的重建,有可能增加肺水肿的发生风险。而肺切除术后肺水肿(PPE)是一种致命的并发症,发生于肺切除术后的早期。据报道PPE的发生率为2.5~5%,报道中的死亡率都很高【1】。也有学者称20%的病人有较轻的PPE【2】,文献报道不太一致。本研究的目的是通过脉搏指示剂连续心排出量(PiCCO)监护仪对肺切除病人术中术后各个阶段的肺血管外肺水(EVLW)的监测,对比单肺通气(OLV)和双肺通气(TLV)两种不同通气方式的变化规律,分析OLV是否为影响EVLW的重要因素,提供临床参考。1 资料与方法1.1 病例选择 采用随机对照病例研究方法,选择2010年3月至2010年10月在我院手术的患者作为研究对象。入选标准:术前无心、肝、肾功能障碍,肺功能正常或仅有轻度通气功能障碍,未经放化疗的择期行肺叶切除术的肺癌患者。排除标准:插双腔管过程中,因个体差异或者体位问题导致管口定位不良,术中病人OLV时通气不好,血氧饱和度(SpO2)无法维持在90%以上;手术过早结束,OLV无法达到2小时以上,或者手术过长,OLV时间超过4小时;术中出现紧急情况病人休克或血流动力学不平稳,需要加大输血输液量的病人。研究经过医院伦理委员会同意,患者或家属签署知情同意书。1.2 分组及麻醉方法 入选病例按随机原则将术式相同患者分别纳入OLV组和TLV组,每组10例,均采用全凭静脉麻醉。1.2.1 麻醉用药方案 麻醉诱导:咪唑安定0.1~0.15mg/kg,异丙酚1.5~2.5mg/kg,芬太尼10~20ug/kg,维库溴铵0.08~0.15mg/kg静脉推注。麻醉维持:芬太尼1~2g·kg-1·h-1静注,异丙酚80~100g·kg-1·min-1,瑞芬太尼0.05~0.20g·kg-1·min-1,及维库溴铵1~2g·kg-1·min-1静脉微量泵全程维持。术后单次给予氟比洛芬酯50mg静脉注射后接静脉自控镇痛(PCA)泵,镇痛药配方:芬太尼2mg+昂丹司琼8mg+氟比洛芬酯100mg,氯化钠注射液稀释至100ml,按芬太尼0.4ug·kg-1·h-1的背景剂量连续静脉输注,自控剂量为0.5ml,锁定时间15min。1.2.2 机械通气方案 诱导后按不同分组分别插入双腔或单腔气管导管。接GE Detex Ohmeda Astiva 麻醉呼吸机维持机械通气。参数设置:吸入氧浓度(FiO2)均为100%;TLV组:潮气量(VT)=10ml∕kg;呼吸频率(F)=16次∕分;吸∕呼比(I∕E)=1:2;呼气末正压(PEEP)=0 cmH2O;维持气道压(Paw)在15~20cmH2O;OLV组: VT=10ml∕kg;F=16次∕分;I∕E=1:2;PEEP=0cmH2O;维持Paw在30~35cmH2O。根据实时监测的血氧饱和度(SPO2)、呼气末二氧化碳分压(PetCO2)及血气分析进行调整。术后拔管前接PB840呼吸机,采用容量控制的同步间歇指令通气(SIMV)模式。参数设置:FiO2=40%; VT=10ml∕kg;F=14次∕分;I∕E=1:2;PEEP=3cmH2O。根据实时监测血氧饱和度(SPO2)及血气分析进行适当调整。1.2.3 输血输液方案 采用常规补液方案:输入液体总量=补偿性扩容+生理需要量+累计缺失量+继续损失量+第三间隙缺失量,晶∕胶比约为2:1;术后:输入液体总量=生理需要量+继续损失量。根据实时监测CVP、MAP、CO、及尿量、血气分析等可进行适当调整,避免容量过度负荷及使用血管活性药物。1.3 监测与研究方法 除一般资料外,余监测指标记录时限为麻醉开始至术后20小时。1.3.1 患者一般资料 两组患者入组时的性别、年龄、手术时间、手术方式、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分。1.3.2 监测方法 麻醉诱导前经右颈内静脉穿刺放置中心静脉导管用以注射热稀释指示剂及测定CVP和接注射液温度探头容纳管。股动脉放置动脉热稀释导管,检测热稀释曲线。连接支持PiCCO监测技术的Philips MP30多功能监护仪。校正动脉压力波形,注射热指示剂(0~4℃冰生理盐水8~10ml)观察其热稀释曲线,监测并记录各种血流动力学参数,包括:中心静脉压(CVP)、心排出量(CO)、平均动脉压(MAP)、系统血管阻力指数(SVRI)、肺血管外肺水指数(EVLWI)、全心舒张末期容量指数( GEDVI)、胸腔内血容量指数(ITBVI)、肺血管通透性力指数(PVPI)等。1.3.3 研究方法 EVLW增加常发生于剧烈的手术操作,手术将近结束和术毕半小时左右。因此,选择麻醉诱导后各项麻醉有创操作完成,手术开始前,血流动力学稳定后首次记录观察指标作为术前基础值(T1),以后分别在各自通气方式下记录通气15min(T2)、30min(T3)、60min(T4)、120min(T5)、150min(T6),术后30min(T7)、1h(T8)、2h(T9)、3h(T10)、5h(T11)、7h(T12)、20h(T13)上述各个血流动力学观察指标。1.4 统计学处理 所有数据以均数±标准差(`x±s)表示,使用SPSS13.0统计软件进行分析,两组间同一指标的差别分析采用重复测量的方差分析;EVLWI与其他指标的相关性采用多元线性相关与回归分析;P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 两组一般资料比较(表1):将每两例手术部位相同的行肺叶切除术的肺癌患者随机分入OLV和TLV组。两组性别、年龄、手术时间、手术方式、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分比较差异均无统计学意义(P﹥0.05)。表1 两组患者一般资料比较组别例数性别年龄手术时间(h)APACHEⅡ评分(`x±s,分)男女(`x±s,岁)TLV组108254.70±6.702.11±0.146.80±1.32OLV组108252.70±12.702.09±0.147.00±1.632.2 术中、术后监测的一般血流动力学变化﹙表2﹚ CO,CVP,MAP,SVRI两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。但是随时间的变化,各指标表现出一定变化趋势(P<0.05)。CO在手术前﹙T4﹚增加,手术中保持平稳,手术后两小时内即拔管前﹙T8、T9﹚增加明显,拔管后稳定但保持在较高的心排出量水平﹙T10~13﹚﹙图1﹚。CVP手术结束前﹙T6﹚呈小幅增加后维持在一定水平但在术后两小时内有倒“V”型变化﹙T7~9﹚﹙图2﹚。MAP在开胸前平稳,开胸后增加﹙T5﹚,至关胸前达最大﹙T7﹚,关胸后略下降﹙T8﹚,以后维持在比术前较高的水平﹙图3﹚。SVRI在开胸前明显减低﹙T4﹚,开胸后显著增加﹙T5﹚,关胸后迅速回落﹙T7﹚,恢复至术前水平﹙图4﹚。表2 一般血流动力学指标的变化指标分组T1T2T3T4T5T6T7T8T9T10T11T12T13CO(ml/min)TLV4.80±2.095.06±2.116.44±3.236.44±3.255.88±2.565.54±2.255.97±1.98*6.74±2.99*6.85±2.32**6.56±2.41**6.69±2.64*6.70±2.05**6.18±2.30*OLV5.12±1.395.53±1.146.01±1.645.83±1.38*5.79±1.665.58±1.847.15±2.17**7.50±2.36**6.73±2.00*6.77±1.98*6.12±2.016.90±2.14**6.82±1.34**CVP(mmHg)TLV7.1±1.57.6±2.68.4±2.38.7±2.3*9.1±2.3*9.4±2.4*11.8±2.1**12.6±2.1**10.8±2.4**9.9±2.2**9.6±3.1*9.6±2.7*10.3±2.1**OLV7.0±2.17.8±1.98.2±2.28.3±2.28.5±2.18.7±3.111.8±3.8**9.8±2.6**8.6±2.38.5±3.08.0±1.98.3±1.77.5±2.4MAP(mmHg)TLV88±1084±1187±1088±1597±11*97±10110±16**108±12**103±11**101±12**100±9**101±6**95±11OLV88±1484±1485±886±1490±1996±13110±14**107±17*94±994±1093±1492±1494±10SVRI(DSM2/cm5)TLV2768±14652449±11641986±9181871±719*2273±9282472±11162304±8622246±8832014±7192127±8082003±5461996±5632031±680*OLV2359±8861973±4881918±5691956±6832101±6402337±8232088±8042031±9261920±6501893±6802077±10431855±7081814±583与T1相比:*,P<0.05 **,P<0.012.3 PiCCO监测技术观察到的特殊血流动力学变化﹙表3﹚EVLWI,GEDVI,ITBVI,PVPI两组间差异亦无统计学意义(P>0.05)。EVLWI与PVPI的变化趋势相同,均随时间的延长而下降,从时间点上看术后20小时﹙T13﹚与术前﹙T1﹚相比已有明显的差异(P=0.000)﹙图6、7﹚。GEDVI与ITBVI组间差异均无统计学意义(P>0.05),在手术结束后一小时内有一个短暂的增加。2.4 EVLWI与其他指标的相关性术中回归方程EVLWI=-4.344+0.008GEDVI+3.989PVPI,可见术中EVLWI与GEDVIa、PVPIb呈正相关(r a=0.504;r(a,b)=0.747);术后回归方程EVLWI=-2.519+3.984PVPI+0.006GEDVI+0.000SVRI,可见术后EVLWI与PVPIa、GEDVIb、SVRIc呈正相关(r a=0.583;r(a,b)=0.898;r(a+b+c) =0.904);总的回归方程EVLWI=-3.515+4.045PVPI+0.007GEDVI-0.065CVP,可见EVLWI与PVPIa、GEDVIb呈正相关,与CVPc呈负相关(ra=0.512;r(a,b)=0.858;r(a+b+c) =0.861)。EVLWI与CO、CVP、MAP、ITBVI均无相关(P>0.05)。3 讨论OLV常用于肺癌根治性切除手术。这类手术技术难度大,需要进行纵隔淋巴结清扫,要求安静合适的手术视野和操作区域。许多外科医师习惯在肺塌陷下操作,可以减少牵拉,提高肺解剖清晰度,缩短手术时间。同时,OLV可以进行两肺分隔通气,防治操作时手术侧的分泌物流入健侧支气管,有很好的肺保护作用。但是,OLV期间由于一侧肺萎陷,很易发生缺氧或低氧血症,长时间的肺萎陷或多次重复萎陷与复张,可损伤毛细血管内皮细胞。气道压增加、双腔管形态学原因,可出现气管粘膜损伤。另外,麻醉过程中纯氧机械通气,有报道【3】其也是术后肺不张低氧血症的原因之一。且OLV过程中,双肺血流大部分流向通气侧肺,肺动脉压力升高,致V/Q失调的同时也可能导致肺泡-毛细血管应力衰竭【4】。因此,OLV的安全性备受关注。EVLW作为肺水肿的早期诊断指标越来越受到人们的重视,而PiCCO技术则使EVLW的监测成为可能,它能敏感的探测EVLW的微小改变(10%一20%)【5】。PiCCO是经肺热稀释法与脉搏轮廓曲线分析技术相结合的监测方法。采用成熟的热稀释法测量单次心排血量(CO),并通过分析脉搏轮廓曲线下面积与CO存在的一定关系,获取连续心排出量(PCCO)及一系列容量参数: EVLW、GEDV、ITBV、PVPI等。然而肺切除术后肺血流量及肺容积均发生了改变,我们有理由怀疑该法的可靠性。有研究【6】证实:PiCCO与肺称重法有密切的相关性(r=0.96,P<0.0001)。即便是单肺切除术后,二者仍然有较好的相关性(r=0.90,P<0.0001)。OLV由于医源性的一侧肺萎陷,导致肺循环的重新分布,有可能导致血管外肺水的改变而增加术后肺水肿的风险。因此,本文通过PiCCO对择期肺癌根治术病人术中和术后20h各项血流动力指标的监测,希望能尽早发现EVLW增多的证据和可能的影响因素,指导OLV麻醉的实施和管理。本研究结果显示:OLV组与TLV组间各项一般血流动力学指标均无显著差异。从时间点上看,CO受应激影响较大,手术前进行麻醉插管与手术后苏醒拔管及拔管后手术部位疼痛等伤害性刺激时均使心排量增加。CVP手术结束前呈小幅增加后维持在一定水平但在术后两小时内有倒“V”型变化。考虑与手术操作过程中术者挤压纵隔、心脏及麻醉机与呼吸机的使用造成胸腔内压力增加有关。在机械通气的情况下,胸腔内压力的增加一方面可以引起CVP增高,另一方面使静脉回流受阻和右室充盈受限【7】。开胸后肺部生理改变及术中使用麻醉药物致心肌顺应性低的情况下,较少的容量也会引起CVP的明显增加。此再次证明CVP反映心脏前负荷及循环血容量的局限性【8】。MAP与SVRI均代表心脏后负荷,二者结果符合开胸肺生理变化,无特异性表现。对PiCCO监测的特殊血流动力学指标的监测结果显示:OLV组与TLV组间各项特殊血流动力学指标同样无明显差异。EVLWI与PVPI的变化趋势相同,均随时间的延长而下降,从时间点上看术后20小时与术前相比已有明显的差异(P=0.000)。但在术后两小时前,EVLWI均保持在增多的水平,然而并未达到肺水肿提示,EVLWI正常值为3.0~7.0 ml/kg,大于2倍则提示有肺水肿【9】。EVLWI增多的可能原因为:(1)肺泡上皮细胞在不同程度的氧化应激反应下可以发生凋亡和坏死,使肺血管屏障遭到破坏,肺血管通透性增加;(2)压力和氧合水平的改变也可能会导致肺泡壁的损伤,并进一步造成液体和蛋白质进入肺泡腔;(3)缺氧或低氧血症加重肺间质的损伤;(4)虽然有炎症因子大量释放,但肺毛细血管上皮细胞受损不足以引起肺血管通透性大幅改变,这可能与机体抗损伤机制和麻醉药物的器官保护作用有关。从过去的研究得知PPE的病生改变与ARDS基本相同,内皮细胞屏障损害是其始动因素。因此监测PVPI对于评价内皮细胞损害具有重要意义。本研究中虽然PVPI术中比术后高,但均在正常范围内(PVPI=EVLW/PBV,正常值是1~3,PBV为肺血容量)。国内有研究也得出了相同结论【10】。在开胸手术中,由于麻醉药的血管扩张作用、机械通气以及缺氧性肺血管收缩等作用可能造成PBV的减少。因此PVPI能否准确的反映开胸手术中肺血管内皮通透性的改变以及可能的影响因素都需要进一步的研究。GEDVI与ITBVI无论是组内时间还是组间差异均无统计学意义(P>0.05)。由于ITBV和GEDV包括左右心房、心室舒张末期的容积,且不受一般手术操作及麻醉、复苏影响,因此能更好的反映心脏的充盈状态,此再次证明它是体现心脏前负荷的优秀指标【11】。本研究结果还表示, EVLWI与PVPIa、GEDVIb明显正相关(r(a,b)=0.806,P=0.000),虽然统计学上与SVRI(r=0.006,P=0.000)、CVP(r=0.003,P=0.000)呈相关关系,但是决定系数(r2)过小,联系临床实际没有意义,因此EVLWI与CO、CVP、MAP、SVRI、ITBVI均无相关(P>0.05)。国内有研究也得出了相同结论【12】。此相关分析除了印证上述结果外,也提示在麻醉与复苏过程中液体治疗不宜过多,与国内外研究结果同【13】。综上所述,OLV组病人围术期及术后的血流动力学和EVLW没有发生明显的变化,OLV对肺癌肺叶切除患者EVLW影响轻微,是一项安全的麻醉操作。在开胸手术中由于胸腔内压力的变化,用CVP反映机体的前负荷状态存在一定的误差,而GEDI和ITBI不受胸腔内压力变化的影响能很好的反映机体的容量状态。虽然由于OLV的病理生理改变可能造成一定的缺血、缺氧性损伤,但在机体抗损伤机制的作用下,不会造成特异性的肺损伤,引起EVLW增多。EVLW的增多主要与血管通透性增加及循环血容量增加有关,提示术中在保持血流动力学稳定的同时,应注意防止容量过度超负荷。参考文献1 Turnage WS,Lunn JJ.Postpneumonectomy pulmonary edema:A retrospectine analysis of associated variables.Chest.1993;103:1646.2 Waller DA,Keavey P,Woofine L,et al.Pulmonary endothelial permeability changes after major lung resection.Ann Thorac Surg.1996;61:1435.3 Hedenstierna G. 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单肺通气(OLV)是胸科手术一种特殊的机械通气模式,然而它在使两侧肺分别通气,为手术提供便利条件的同时也不可避免地会产生一些不良反应。在临床麻醉工作中,OLV引起的肺损伤越来越受到重视,但OLV所致肺损伤的发病机制尚未阐明。近年来,细胞凋亡在肺组织损伤中起着重要的的作用,有研究认为在机械通气的早期就有肺泡上皮细胞凋亡的发生[1],而对OLV过程中肺组织细胞凋亡的研究少见报道。本实验旨在研究OLV时肺组织细胞凋亡指数及凋亡执行因子Caspase-3的表达,分析其变化与OLV所致肺损伤的关系。材 料 与 方 法动物分组 健康SD雄性大鼠42只,体重200~250g(由广西医科大学实验动物中心提供)。分成空白对照组(C组),双肺通气对照组(B组), 单肺通气组(A组)。C组为自主呼吸组,A组和B组分别分成三个亚组:A1组(OLV 0.5h,恢复通气0.5h),A2组(OLV 1h,恢复通气0.5h),A3组(OLV 1.5h,恢复通气0.5h)和B1组(双肺通气1h),B2组(双肺通气1.5h),B3组(双肺通气2h)。大鼠随机分配,每组6只,共七组。 模型制备 A组大鼠予氯胺酮80mg/kg,速眠新Ⅱ0.6~0.8ml/kg肌肉注射实行麻醉,行气管切开并插入自制气管导管至主气管,给予维库溴铵2mg/kg,待呼吸渐微弱,接呼吸机(江湾Ⅰ型微型动物呼吸机)进行机械通气,通气参数为:氧浓度(FiO2):100%,潮气量(VT):10ml/kg,呼吸频率(RR):60次/min,于左侧第五肋间开胸,暴露左肺,将气管导管过深插入至右侧支气管,调节通气参数VT:5-6ml/kg,RR:80次/分,见左侧肺叶萎陷,对侧肺通气,开始计时,至预定时间将气管导管退回主气管开始复张,恢复至双肺通气时的通气参数。B组则于暴露左肺后,始终保持双肺通气至预定时间。标本采集 C组大鼠麻醉后迅速颈动脉放血处死,A组和B组通气至预定时间后立即颈动脉放血处死动物,分离两侧完整肺叶,置入预冷的生理盐水中,漂洗数次,以清洁表面的血迹,用滤纸吸干,分别取部分左肺下叶组织置入4%多聚甲醛固定48h,脱水后石蜡包埋,做肺组织切片。取余下左肺下叶组织,-80℃超低温冰箱保存待检。检测项目与方法 HE染色光镜下观察肺组织形态结构的改变;免疫印迹法检测肺组织中Caspase-3蛋白的表达,Image Lab凝胶图像分析系统对胶片扫描后的Western blot反应蛋白条带图像进行分析,得出目标带的灰度值,计算出各组目标蛋白条带的灰度值和内参GAPDH蛋白条带的灰度值的比值;原位末端标记法(TUNEL)染色检测肺组织的细胞凋亡指数 (每张切片选取10个不重复视野,细胞核呈棕黄色染色为阳性细胞,计算每高倍视野中阳性细胞数和该高倍视野中细胞总数的比值),计算平均值。统计学分析 经SPSS13.0软件包进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x(_)±s)表示。各亚组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用 LSD-t检验。相对应亚组间样本比较采用t检验; P<0.05为差异有统计学意义。结 果HE染色 C组肺组织无明显病理改变,肺泡结构形态完整,肺泡间隔正常;B组中B1组无明显病理改变,随通气时间增加B2,B3组肺泡内可见少量渗出液,肺间质增厚;A组中A1组可见少量渗出液,肺间质增厚;A2组、A3组非通气侧肺泡内可见大量红细胞,部分肺泡腔萎陷不张,肺间质增厚明显。TUNEL染色 C组肺组织内未见明显凋亡细胞;B组在双肺通气2h肺组织内可见少量凋亡细胞。A组内各亚组随着通气时间的延长,A1组内未见明显凋亡细胞, A2组肺泡腔内侧面可见少量阳性细胞,其细胞凋亡指数较B2组明显增加(P<0.05),A3组肺泡腔内侧面和肺间质的阳性细胞明显增多,其细胞凋亡指数与B3组比较明显增加(P<0.05)肺组织Caspase-3蛋白含量 与C组比较,A1组Caspase-3蛋白含量没有明显变化(P>0.05),A2组和A3组表达增加(P<0.05),且随着通气时间的延长,C组=A1组<A2组<A3组(P<0.05);与B组各亚组比较,A1组和B1组差异无统计学意义(P>0.05),A2、A3组均较与之相对应的B2、B3组表达增加(P<0.05)。表1 各组大鼠肺组织细胞凋亡指数和Caspase-3蛋白表达的比较(n=6,`x±s)检测指标C组A1组A2组A3组B1组B2组B3组AI(%)0.12±0.080.13±0.086.17±0.75 ab16.00±1.10 ab0.15±0.100.18±0.084.83±0.75 aCaspase-30.21±0.020.22±0.020.34±0.01ab0.69±0.01ab0.22±0.010.23±0.010.28±0.01a与C组比较,aP<0.05;与B组对应亚组肺相比较bP<O.05;讨 论OLV作为一种特殊的机械通气现已广泛应用于胸外科手术中,但OLV期间由于非通气侧肺的血液没有得到充分的氧合而造成静脉血掺杂,从而引起肺组织缺氧,并导致肺组织细胞损伤以及功能的损害,此外,肺萎陷后复张及在复张通气过程中过度的牵张等都可引起一系列反应,可加重并且引起肺损伤[2],甚至可引起VILI。实验结果发现,随着OLV时间的延长,大鼠肺组织逐渐表现出肺泡结构的破坏并出现充血水肿,肺间质逐渐增厚等变化,与前期研究结果一致[3]。OLV引起肺部损伤涉及机械伤、生物伤等多种复杂的损伤机制。近年来的许多研究认为,各种因素通过诱导肺组织细胞的过度凋亡导致肺泡结构破坏,加重肺泡毛细血管膜的损伤而参与急性肺损伤的过程[4]。在机械通气的研究中,主要认为支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞由于机械牵拉的刺激,通过激活NF-κB的炎症级联反应,促进细胞的凋亡[1]。本实验中双肺通气对照组在通气2h时肺组织中可见有少量凋亡细胞;而在OLV组中,随着OLV时间的延长,在OLV1h复张0.5h时大鼠肺泡腔内侧面即可见少量凋亡细胞,OLV1.5h后复张0.5h时大鼠肺泡腔内侧面及肺间质中发现有较多凋亡的细胞,这些变化比在相同时间双肺通气组大鼠肺组织中表现更为明显。造成此种情况的原因可能与OLV经历了萎陷后复张通气复杂的病理生理过程相关,而这种复杂的过程可能比单纯的机械牵拉对肺组织细胞凋亡的影响更大。Krick及其同事[5]研究发现在低氧的状态下大鼠通过诱导低氧诱导因子 (HIF-1)可引起肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。在OLV过程中,非通气侧肺萎陷,肺泡氧分压下降,使得非通气测肺组织缺氧,可导致肺组织细胞的凋亡。而这种肺泡氧分压下降后可引起肺血管阻力增加即非通气侧肺缺氧性肺血管收缩(HPV),是肺循环对缺氧的一种代偿反应,但是HPV在起到这些保护作用的同时,也减少了肺组织的血流灌注量。OLV时肺组织的低血流灌注及缺氧可激活肺组织中PMN, 激活的PMN耗氧量大增,不但进一步增加组织的缺氧,而且还释放大量的细胞因子和炎症介质。OLV组大鼠在OLV至预定时间后,均恢复通气0.5h,当恢复通气后,肺组织氧供的快速恢复也可激活肺组织中PMN并激活氧化应激反应,可使血液和肺组织中氧自由基、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-lβ(LI-lβ)等炎性介质增加[6]。游志坚等[7]的研究结果也表明兔OLV时肺组织氧化应激水平显著升高,并且随着OLV时间的延长,这种趋势表现的更为明显。然而大量的氧自由基、TNF-α和LI-lβ等炎性因子均可导致肺泡上皮细胞及血管内皮细胞凋亡的增加,并导致肺血管内皮屏功能的障碍 [8]。An S等[9]认为小肠缺血再灌注后通过上调TNF-α导致Ⅱ型上皮细胞凋亡从而引起肺组织损伤。在非通气侧肺萎陷后复张的过程中,肺泡的膨胀并非都是协调的,膨胀和萎陷肺泡交界处产生的界面切力对肺泡壁过度牵张可引起肺泡上皮细胞的凋亡[10]。本实验中随着OLV时间的延长肺组织凋亡细胞增多,可导致肺泡结构破坏和肺组织病理变化加重,这与本实验中光镜下观察到的肺组织病理改变相一致。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效应因子,在凋亡的执行阶段,它负责对全部或部分关键性蛋白酶的裂解,从而使DNA片断化,导致细胞凋亡。因此大鼠肺组织Caspase-3蛋白表达的变化也可直接反应肺组织中细胞凋亡的情况。为了进一步了解OLV引起细胞凋亡的机制和作用途径,我们用免疫印迹法研究Caspase-3蛋白表达量的改变。从实验结果看,Caspase-3蛋白表达的变化和TUNEL检测的细胞凋亡变化的趋势大体一致,因而也证实了TUNEL法检测的结果。综上所述,随着通气时间的延长,OLV可导致肺组织结构的改变,并导致细胞凋亡及其凋亡执行因子Caspase-3蛋白表达增加,由此推测细胞凋亡可能是OLV导致肺损伤的重要因素。但关于更具体的作用机理,还有待于进一步研究。参 考 文 献[1] 赵兵,张华茹,李海明等.大鼠机械通气相关性肺损伤与肺组织细胞凋亡的关系[J].中国实用医刊,2011,38(3):50-52.[2] Plataki M, Hubmayr RD. 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水通道蛋白在体内广泛分布,具有特殊的分子结构和生物学特性,属膜主体内在蛋白(Major Intrinsic Protein, MIP)家族成员,具有增加细胞膜水通透力的功能,可以提供快速液体转运的途径。其中,AQP-5主要表达在Ⅰ型上皮细胞的顶膜,其主要功能是参与水转运及腺体分泌,与气道高反应性有关[1]。单肺通气技术(one-lung ventilation,OLV)广泛应用于胸科手术中,可以为术者创造良好的操作条件,减少肺部并发症,避免手术侧肺的分泌物或渗出物流入健侧通气肺,但OLV过程中常引起肺内分流增加导致低氧血症等改变,肺水肿也是其严重并发症之一。因此,研究单肺通气与AQP-5的关系具有一定的临床参考意义。近来,有人主张左主支气管结扎法和气管插管过深法建立兔OLV模型[2, 3]。因大鼠支气管与血管结合紧密且脆弱易破极难将两者分离,我们分别采用左侧主支气管连同血管一并夹闭[4]和气管过深插管建立两种大鼠单肺通气模型,通过免疫印迹法定量检测各组大鼠AQP-5表达的变化,研究AQP-5在OLV过程中与急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)的关系,探讨缺血再灌注损伤在AQP-5表达变化中所起的作用。1.材料和方法1.1 实验动物和分组:SD大鼠60只,广西医科大学实验动物中心提供,雄性,体重200~250g。分为夹闭左侧肺门OLV组(A组),过深插管OLV组(B组),双肺通气对照(C组),空白对照组(D组)。A、B、C组分别按不同通气时间再分三个亚组,A1组:OLV0.5h,复张0.5h,总通气时间1.0h;A2组:OLV1.0h,复张0.5h,总通气时间1.5h;A3组: OLV1.5h,复张0.5h,总通气时间2.0h;B1:OLV0.5h,复张0.5h,总通气时间1.0h;B2组: OLV1.0h,复张0.5h,总通气时间1.5h;B3组:OLV1.5h,复张0.5h,总通气时间2.0h;C1:双肺通气1.0h;C2:双肺通气1.5h; C3:双肺通气2.0h。用excel随机函数表随机分配,各亚组和空白对照组每组6只。1.2主要试剂: AQP-5兔抗鼠多克隆抗体购自Abcam公司(1:10000稀释),羊抗兔二抗和GAPDH内参抗体购自Santa Cruz公司(1:500稀释),PVDF 膜购自大连宝生物有限公司。1.3实验模型的建立 1.3.1 实验动物的麻醉和监护 实验大鼠予肌注氯胺酮80mg/kg,速眠新2(第二军医大学研制)0.6~0.8ml/kg[5],取仰卧位,予颈部及左侧胸部备皮,固定四肢。待大鼠进入完全麻醉状态,沿颈部正中纵向切开,暴露气管,于第一环状软骨下缘气管切开,置入气管导管(自制)约2cm,给予维库溴铵2mg/kg,待呼吸渐微弱至停止(约5分钟)接呼吸机(江湾Ⅰ型微型动物呼吸机),VT10ml/kg,RR60次/min,纯氧接入。除空白组外所有大鼠均于麻醉诱导后行颈动脉穿刺置管监测心率和有创血压,体表血氧探头检测血氧饱和度。血压能够较平稳地维持于80/60mmHg~140/110mmHg(1mmHg=0.133kPa)之间,血氧饱和度维持在90%~100%,心率约200~400次/min。1.3.2实验动物模型的制作 轻柔操作,将大鼠置于右侧卧位。于左侧胸第五肋间开胸,去除第五肋部分肋骨,暴露肺叶。A1、A2、A3组将左侧肺门部以套胶皮管的微型血管钳夹闭,立即调节VT至5ml/kg,RR80次/min,见左侧肺叶不张,可良好地观察到右肺3、4叶,开始计时,复张时除去血管钳,调节VT至10ml/kg,RR60次/min[4],约5min~10min后肺复张良好。B1、B2、B3组于暴露肺叶后将气管导管推进至3.0cm~4.0cm处,使导管进入右侧支气管,调节VT为5ml/kg,RR80次/min,见左侧肺叶不张,可良好地观察到右肺3、4叶,开始计时,复张时将气管导管退回至2cm处,调节VT10ml/kg,RR60次/min,约5min后肺复张较好。C1、C2、C3组于暴露肺叶后,可见肺膨胀良好,开始计算时间。其OLV过程有时有少量漏气,可观察到非通气侧肺有点状通气,如漏气较严重时需要对导管稍作调整。1.3.3 实验动物的标本采集和保存 空白组予相同方法麻醉后迅速处死,其余各组达到预定通气时间后立即处死,因需比较相同部位及两侧对应部位的肺组织,分别取部分左肺下叶和部分右肺第3、4叶肺组织,4%多聚甲醛固定48h,脱水后石蜡包埋。取余下左肺下叶和右肺第3、4叶肺组织置于液氮罐中迅速冷冻,并转移至﹣80℃低温冰箱保存。1.4蜡块5μm厚切片,HE染色光镜观察。1.5免疫印迹分析AQP-5表达的变化 低温下取肺组织(50±5)mg,剪碎加入预冷的6倍体积的RIPA裂解液和1:300的蛋白酶抑制剂,匀浆后10000r/min离心5min,取上清液。用BCA标准曲线法测定蛋白浓度,样品1:4体积加入×SDS2PAGE上样缓冲液,70℃水浴10分钟,GAPDH为内参,SDS-PAGE凝胶电泳,转PVDF膜,一抗(1:10000)孵育,4℃过夜,洗膜,加入二抗(1:500),常温孵育一小时,洗膜后暗室曝光,胶片显影,用QUANTITY ONE图像分析系统对扫描后的蛋白条带图像进行分析,数值越大,表示灰度值越大。1.6 统计学处理 以AQP-5目的蛋白条带的灰度值和内参GAPDH蛋白条带的灰度值的比值做统计学分析。应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,计量资料均以`x±s表示,各组数据服从正态分布并满足方差齐性要求,比较A、B、C组组内各亚组及D组有无差异、相同时点各亚组有无差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA),各亚组左右两侧比较、各亚组及空白对照组组间两两比较采用 LSD-t检验,检验水准ɑ=0.05, P<0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1 肺组织大体观察 ①D组大鼠肺组织,肺组织呈现萎陷状态,浅红色,质均匀。② C组肺组织大体呈粉红色,质均匀。③A组,非通气侧复张较好,复张过程中有少部分肺组织复张不良,呈点状或小块状暗红色,复张良好肺组织呈粉红色,通气侧肺组织均匀呈粉色。④B组大体与夹闭一侧肺OLV相近。各实验组及双肺通气组肺组织随通气时间的增加有肿胀趋势,但外观无明显肺水肿。2.2 光镜观察 ①D组大鼠肺泡腔清晰,肺泡大小均匀,间隔纤细,毛细血管内可见血细胞。②C组可见肺组织肺泡间隔增宽,随通气时间增加,肺间隔增宽明显,部分肺泡腔内出现少量红细胞,通气时间2.0h各亚组可见毛细血管扩张充血,部分肺泡壁破裂,肺泡腔融合,腔内可见红细胞,呈肺水肿表现,左右两侧变化一致。③A组的变化与C组相近,通气侧肺组织变化较非通气侧轻,主要表现在非通气侧肺泡腔内红细胞数量较多。④B组的变化与C组相近,通气侧与非通气侧变化差别不大。2.3 Western blot结果显示:结果如表1及图1、图2所示。D组肺组织AQP-5呈较高水平的阳性表达,均高于A、B、C组内各亚组(P<0.05)。各亚组左右两侧肺AQP-5的表达无统计学差异(P>0.05)。A、B、C组组内各亚组比较差异均有统计学意义(P<0.05), A1、B1、C1组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);A2、B2、C2组间比较,A2组较B2组和C2组AQP-5的表达减少(P<0.05),B2组和C2组无统计学差异(P>0.05);A3、B3、C3组间比较,A3组、B3组均表现出与C3的区别(P<0.05),且A3组比B3组AQP-5的表达减少(P<0.05)。表1免疫印迹法定量检测肺组织AQP-5蛋白的表达(n=6,`x±s)1.0h1.5h2.0h A组1.88±0.07cd0.97±0.07abd0.53±0.11abB组1.82±0.07cd1.43±0.11d0.77±0.07bC组1.71±0.22cd1.41±0.23d 1.02±0.05与B组比较aP<0.05;与C组比较bP<0.05; 与1.5h组相比cP<0.05;3.讨论AQP-5是肺组织液体快速转运的通道,对维持肺组织的正常生理功能起着重要作用。急性肺损伤(ALI)是指机体遭受严重感染、创伤、辐射、休克等打击后, 出现的以弥漫性肺泡上皮细胞和肺泡毛细血管内皮细胞膜损伤为病理特点的综合征。胸科手术中存在手术损伤、机械通气性损伤、氧化应激反应、液体超载,麻醉药物、细胞因子等致ALI病因。有研究表明,促进AQP-1和AQP-5的表达,可以加快肺水的运输和清除,提高水的平衡,消除肺水肿,从而有效地防治急性肺损伤[6]。李波等研究得出的结论认为AQP-1和AQP-5可能参与ALI液体的异常转运,与肺水肿的发病机制有关[7]。我们从实验大鼠的肺组织病理切片观察到,随通气时间的延长,肺组织出现了肺水肿征象,这与通气过程中的ALI关系密切,提高AQP-5的含量或者活性,可能有利于消除肺水肿,对防治ALI有积极的意义。OLV可使肺内分流增加,这时产生缺氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction,HPV)是机体维持通气和血流比相适应的代偿性保护机制。本实验中A组单肺通气时阻断了一侧肺的血流,这时单肺通气过程并没有增加肺内分流,理论上此时该侧肺不需要HPV代偿机制,阻塞解除后,萎陷的肺达到良好复张的一段时间内同时存在HPV代偿机制和缺血再灌注损伤机制。B组在行单肺通气时即可发生HPV,减少肺通气侧血流,调节通气/血流比,萎陷的肺达到良好复张的一段时间内仅存在HPV代偿机制,无缺血再灌注损伤机制。有人在实验中观察到再灌注后肺组织超氧化物歧化酶(SOD)含量进行性下降,并认为肺缺血再灌注损伤可能与肺内细胞因子释放增加,中性粒细胞聚集、激活、氧自由基产生和清除失衡有密切关系[8]。此外,缺血时间的长短,与再灌注损伤的发生与否有关[9]。OLV时肺非通气侧由于阻塞导致缺血或HPV导致低灌注,肺随阻塞去除而复张同时伴随肺组织的再灌注可导致氧自由基的产生[10],通气侧则可能同时受到高氧、容量伤和低灌注导致的的复合损伤。我们的实验结果显示各亚组左右两侧肺AQP-5的表达变化是一致的,即夹闭侧与对侧的变化程度相当,由此可见AQP-5的调节在此体现于全肺组织。实验组和双肺通气对照组与空白对照组相比AQP-5蛋白表达下降,表现出与机械通气时间相关,单肺通气较双肺通气AQP-5表达下降,且夹闭方式比过深插管方式更早出现AQP-5的下降,在此缺血再灌注损伤机制可能对AQP-5的下调起到了一定的促进作用。OLV时AQP-5的表达比双肺通气减少,也可能与机械牵张及复张性肺水肿有关。机械正压通气,萎陷和复张过程,开胸手术操作对肺组织的牵拉等机械牵张过程,及通过诱导炎性介质表达和释放,可引起呼吸机所致肺损伤(ventilator-induced lung injury ,VILI)[11]。复张性肺水肿(reexpansion pulmonary edema,RPE)是继发于各种原因所致的肺不张在肺迅速复张时(或之后)所发生的急性肺水肿。复张性肺水肿的发生机制较为复杂,与下列因素有关: ①复张时毛细血管机械损伤,使毛细血管内皮细胞间隙增宽,同时由于肺膨肺时毛细血管内压增加,可促使水分、蛋白质和细胞成分漏出至肺间质和肺泡内。②肺泡表面活性物质减少,活性降低,肺泡表面张力增大,形成肺水肿。③缺血再灌注损伤[12, 13]。④炎症介导反应。在本实验中,夹闭法OLV有可能受到更多的机械牵张,这是无法排除的影响因素之一。AQP-5的表达与时间的相关性受上述方面所影响。有研究表明兔OLV时肺组织氧化应激反应的水平显著升高,随着OLV时间的延长,这种趋势表现的更加明显[14]。从上述机制可以见,单肺通气时间越长,再进行复张时,复张性肺水肿有可能越严重。有人认为OLV期间间断双肺通气可减轻肺损伤[15]。缩短OLV时间是提高手术的安全性有效途径之一。多长时间的一侧肺不张在安全范围内,是麻醉及手术过程中需要充分注意的问题。应用AQP-5的生理功能防治肺水肿,增加单肺通气的安全性,增大安全时限的范围以适应更多复杂的手术,有进一步研究的意义。刘文粤等进行的临床研究结果表明,在检测肺动脉压(PA)条件下,减少非通气侧肺血流在单肺通气期间可减少肺内分流,明显改善动脉血氧[16]。在临床上应用部分阻断或间断性地阻断血流行单肺通气,同时增加AQP-5的含量和活性,可能有利于保证循环的稳定和减少肺水肿,更利于手术实施,值得更深入地研究。综上所述,机械通气可引起AQP-5表达的下调,单肺通气下更加明显,且与时间相关。夹闭法单肺通气较插管过深法单肺通气AQP-5表达的下调出现更早程度更大。参 考 文 献[1] Krane C M, Fortner C N, Hand A R, et al. 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黄冰 黎阳 刘立义 茅乃权 阮林 彭丹晖患者,男性,年龄67岁,身高170 cm,体重68 kg。主诉咳嗽、咯痰、呼吸困难1月余。门诊诊断:右肺不张、右肺炎、右胸腔积液收入院。起病后无发热、咯血、胸闷、胸痛、心悸、咽部异物感,亦无明显体重下降,近日出现夜间入睡困难。食欲可、大小便正常。神清,无气促,无紫绀,呼吸运动正常,双上肺呼吸音粗糙,双下肺闻及少许痰鸣音,右下肺呼吸音较弱。门诊胸片示右肺不张、右肺炎、右胸腔少量积液。入院后CT/MRI示主气管肿物,主气管阻塞约80%,且肿瘤底部较窄(图1、2、3)。纤维支气管镜检:气管下段见一约1cm的肿物,将气管几乎完全堵塞,肿物表面光滑,血管网清晰,有一小片状糜烂(图4)。活检送病理和细胞学检查;病理结果示气管腺样囊性癌;细胞学检查示炎性改变,未发现癌细胞。肺功能检查:用力肺活量(FVC):3.11L,一秒用力呼气容积(FEV1)/FVC:61%,3秒用力呼气容积(FEV3)/FVC:99%,提示轻到中度阻塞性通气功能障碍。住院一周后修正诊断为:主气管下段巨大腺样囊性癌。术前多科室会诊后,制订患者个体化麻醉管理方案:(1)取左侧卧位,拟在全身麻醉下行主气管腺样囊性癌切除,并癌段气管袖状切除,主气管端端吻合;(2)纤维支气管镜引导下气管插管,管尖停留于肿物上方;(3)开胸后尽快切除肿物,将原导管送入左主支气管行单肺通气麻醉,必要时于术野切开右主支气管,加插气管导管行喷射通气;(4)气道重建后退出导管至吻合口上方,恢复双肺通气,至手术结束,患者完全清醒后拔除气管导管。(5)充分术后镇痛,保持病人颏胸位以减少气管吻合口的张力。次日手术麻醉按计划进行。麻醉实施:表面麻醉,1%地卡因喷喉;环甲膜穿刺后用2%利多卡因2ml气管内注射;纤维支气管引导气管插管,管尖停留于肿物上方;套囊充气至囊内压40 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa);接麻醉机用容控呼吸,VT 550 ml时,气道压力23 cm H2O,通气良好。静脉注射咪达唑仑5 mg、异丙酚100 mg、芬太尼0.2 mg、维库溴铵4 mg,左侧卧位开胸。静脉输注瑞芬太尼0.08~0.10μg·kg-1·min-1,异丙酚80~100 μg·kg-1·min-1,间断静脉注射维库溴铵0.2~0.4 mg维持麻醉。术中从开胸到肿瘤切除时间为35 min,肿瘤切除后,将气管导管送入远端气管。由于左支气管角度太大,未能按计划将气管导管送入左主支气管,虽然术前讨论已估计到,但实施操作比预计要困难,被迫临时将导管送入了右主支气管,右侧单肺通气时间15 min。由于病人左侧卧位,右侧开胸,在重力作用以及手术干扰下通气血流比失常,血氧饱和度最低时仅85%。手术医生尽快游离左肺根部,隆突暴露完全后,外科和麻醉科医生配合将气管导管送进左主支气管,套囊内压30 cm H2O。左肺单肺通气后,血氧饱和度正常,手术修整主气管残端,并行主气管端端吻合。完成气管吻合并组织包埋后,将导管推到吻合口上方,恢复双肺通气,期间左肺单肺通气时间50 min。加压通气以确认没有吻合口漏气,止血冲洗,清扫淋巴结,结束手术。手术时间3 h 10 min。术后行静脉镇痛,颏胸体位,呼吸机支持治疗3 h,病人清醒配合后拔除气管导管。手术切除的肿瘤实际大小为:2.7 cm×2.0 cm×1.8 cm(图5),病理结果示:腺样囊性癌,侵犯气管全层;淋巴结共6个,均为慢性炎;两端气管切缘未见癌。考虑到癌已侵犯气管全层,术后行一个疗程的加强放疗;术后20 d,纤维支气管镜检示:气管距隆突1.5 cm处见手术切口缝线残留,周围粘膜较潮红,管腔通畅,两肺支气管粘膜未见异常。术后25 d痊愈出院。讨论 气管腺样囊性癌患者早期无症状或仅有轻度呼吸不畅。肿瘤占据气管腔超过75 %可出现阻塞症状,但症状均无特异性。咳嗽、咯痰、间歇痰中带血可能是最初的临床表现,为多数疾病所共有,因而容易导致误诊【1】。CT扫描是早期发现本病的首选检查手段,可较准确地反映原发性气管癌的位置及气道受阻程度。但确诊需要行喉镜或纤维镜检查。早期确诊,积极手术切除对预后极为重要【2】。气管手术麻醉的关键在于气道的管理, 必须确保气道通畅、通气氧合良好, 同时还需为手术提供开阔的术野, 避免影响手术的操作【3】。因此,个体化的麻醉方案设计非常重要。本例的经验与体会是:(1)术前要对患者的气管梗阻情况做充分评估,鼓励患者呼吸锻炼,抗炎治疗,为每个气管肿瘤的手术患者建立个体化的麻醉方案。本例病人内镜检查发挥了非常重要的作用,术前检查确认肿瘤位置以及气管梗阻的程度,为麻醉医生评估插管位置和选用管子的大小奠定了基础。(2)更为重要的是,我们选择了在纤维支气管镜的引导下,进行清醒气管插管,防止肌松药的不良影响。插管过程要充分表面麻醉,喷喉并加以环甲膜穿刺用药;减少气管镜检查引导期间可能诱发的心血管反应或气管痉挛;(3)与外科医生密切配合,随时调整导管位置、套囊压力和通气方式;左侧卧位行左主支气管插管有一定困难,必须有充分的准备并做好应变措施。(4)全程密切监测生命体征;(5)延长术后呼吸支持时间,病人完全清醒配合后拔除气管导管,防止拔管过程导致患者躁动;(6)充分的术后镇痛,保持颏胸位是术后愈合的重要措施。(7)病人恢复后,仍然用纤维气管镜确认吻合口完全愈合,为该病例的完全愈合提供了临床依据。综上所述,气管腺样囊性癌起病隐匿,经常在门诊误诊为气管炎或肺炎而久治不愈,往往等到出现呼吸困难才被确诊,因此,CT/MRI、纤维气管镜的检查对这类疾病的诊断尤为重要。一旦确诊以手术治疗为首选,麻醉医生术前应和内镜医生、手术医生一起制定手术和麻醉方案,术中的气道管理尤为重要,需要制定多种可行的通气管理方案,麻醉医生必须具备熟练的通气管理和评估技术,随时调整通气管理方法。本例的成功之处在于准确评估,细心准备,多学科密切配合,灵活应变。参考文献[1] 朱元珏,陈文彬. 呼吸病学. 第一版.北京:人民卫生出版社, 2003,1051-1052.[2] 王磊,钟竑,梅举,等.巨大气管腺样囊性癌伴结节性甲状腺肿一例报道.上海交通大学学报医学版,2010,30(4),485-487.[3] 许建,高天华. 气管肿瘤切除与气道重建手术麻醉处理, 中华麻醉学杂志,1999,19(7),431-431.