吴汉青医生的科普号

在看到中南大学湘雅医院教授罗学宏一篇文章,觉得很好.虽蛇咬伤不常见,但一旦发生就是急危症,所以还是推荐给大家.目前毒蛇咬伤仍是我国广大农村的常见病。早期诊断与处理正确与否直接关系着患者的生命安危。笔者发现在临床治疗毒蛇咬伤的过程中仍然存在着一些误区，严重影响着患者的预后，值得引起关注。 误区一 一旦呼吸骤停，大剂量应用呼吸兴奋剂被神经毒类毒蛇咬伤，病情严重的患者往往会出现呼吸浅而慢，甚至呼吸骤停。出现这种情况的主要原因是蛇毒阻断了神经肌肉接头的传递作用。呼吸兴奋剂不仅对此并无拮抗作用，还会增加机体对能量及氧气的消耗。因此，被毒蛇咬伤后出现的呼吸麻痹，主要是要解决呼吸肌的动力问题——早期给予呼吸机支持。只有在病人的呼吸功能逐渐恢复，并出现微弱的呼吸时，适量使用呼吸兴奋剂，才会对病人自主呼吸的恢复有所帮助，否则适得其反。 误区二 抗蛇毒血清用量大，抗毒效果好抗蛇毒血清是目前国内外公认的对抗蛇毒的特效药。其作用机理是中和未与靶器官结合的游离蛇毒，阻止蛇毒继续对人体造成损害。临床实践和动物实验都证实了，用其治疗越早疗效越好。治疗剂量要足，原则上是指抗蛇毒血清的用量应超过被咬时注入的蛇毒量，才能彻底中和进入体内蛇毒素的毒性。因此，抗蛇毒血清用量，应取决于蛇咬伤的注毒量。但实际上，这个量难于测定，一般认为一支抗蛇毒血清足以中和一条毒蛇的毒力。国外最近提倡用小剂量抗蛇毒血清，认为剂量过大反而有害。 误区三 孕妇被毒蛇咬伤，不能应用抗蛇毒血清有人害怕抗蛇毒血清对孕妇和胎儿有影响，而不敢对孕妇应用抗蛇毒血清。蛇毒（神经毒、血循毒、混合毒）素和抗蛇毒血清制品对胎儿是否有损害，这是国内外蛇伤防治领域的一个研究热点。目前研究认为，蛇毒中的主要有毒物质不会直接通过胎盘屏障影响胎儿发育，但蛇毒可引起孕妇呼吸衰竭、肾功能衰竭、出血、溶血、DIC等。蛇毒并发症可引起胎儿宫内窘迫，导致流产、早产、死胎，甚至母婴死亡。研究还证明，抗蛇毒血清制品的纯度高，中和力强，副作用少，是治疗孕妇毒蛇咬伤的安全特效药，关键是要尽早使用足量的有针对性的抗蛇毒血清。 误区四 儿童被毒蛇咬伤，使用抗蛇毒血清剂量应比成人少抗蛇毒血清治疗毒蛇咬伤有特效，其机理就在于抗蛇毒血清能中和未被结合的毒素，早期应用一支抗蛇毒血清就能中和一条相应毒蛇所释放的毒素。因此，老人、小孩、体弱者和健康成年人的抗蛇毒血清使用剂量是相同的。随意减少老人、小孩、体弱者的抗蛇毒血清的使用剂量，是错误的。 误区五 使用促凝血药物某些被五步蛇或蝰蛇咬伤的病人，常出现伤口出血不止或全身出血现象，甚至发生失血性休克。这时应用促凝血药，如止血敏、6－氨基已酸（EACA），或输新鲜血，往往难以达到预期的止血目的，甚至加重出血。这是因为这类毒蛇中含有凝血酶样酶成分和出血毒素。其中凝血酶样酶成分可直接作用于纤维蛋白原，使其变成纤维蛋白，进而引发消耗性凝血障碍。出血毒素可破坏毛细血管壁及其细胞间质的黏性物，使毛细血管壁的通透性增加而引起出血。蛇毒毒素未完全清除之前输入新鲜血液同样会被蛇毒破坏，起不到补充血容量的作用。正确的治疗方法是要应用足量抗蛇毒血清、肾上腺皮质激素和维生素C静滴，对流血不止的伤口，可用浸有去甲肾上腺素的纱布外敷，外用绷带加压包扎。盲目应用抗凝血药物，是无济于事的。中南大学湘雅医院教授罗学宏

第17卷第12 期2008年12 月中国普通外科杂志Chinese Journa l of Genera l Surge ryVo.l 17 N o. 12Dec. 2008收稿日期: 2008- 06- 02; 修订日期: 2008 - 11 - 11。作者简介: 吴汉青, 男, 华中科技大学同济医学院附属协和医院住院医师, 主要从事颈动脉体瘤及血栓方面的研究。通讯作者: 金毕 Em ai:l j inb@i yah oo. com. cn 文章编号: 1005- 6947( 2008) 12- 1210- 03 临床研究Cockett综合征合并股青肿的综合治疗分析:附7例报告吴汉青, 金毕, 吕平, 李毅清, 欧阳晨曦, 夏印( 华中科技大学同济医学院附属协和医院血管外科, 湖北武汉430022) 摘要: 目的 探讨应用下腔静脉滤器置入、手术取栓、静脉溶栓综合治疗Cockett综合征合并股青肿( PCD ) 的途径及疗效。方法 对10年间收治的Cockett综合征合并PCD 的7 例患者的临床资料进行回顾性分析。结果 7例均有典型PCD 表现, 其足背动脉、胫后动脉搏动均消失; 均经多普勒检查证为Cockett综合征合并PCD; 均行手术治疗。3 例行腔静脉滤器植入术, 3 例行球囊导管阻绝术, 1例患者行PALMA 术, 7例均行术中取栓和术后溶栓治疗。7 例术后患肢足背动脉搏动均恢复, 疼痛消失, 消肿, 未出现手术并发症。经6 个月至3 年随访, 未见血栓复发及其他并发症发生。结论 综合介入、手术、溶栓治疗Cockett综合征合并PCD 不仅成功率高, 近期疗效好, 而且安全可靠。[ 中国普通外科杂志, 20 08, 17( 12) : 1210- 1212 ]关键词: Cocke tt综合征/治疗; 股青肿; 腔静脉滤器; 溶栓; PALMA 术中图分类号: R 654. 4 文献标识码: ACombined therapy for patients w ith Cockett syndrome complicated w ithphlegmasia cerulea dolens: a report of 7 casesWU H anq ing, JIN B i, LU Ping, L I Y iqing, OUYANG Chenx i, X IA Y in( Departmen t of Vascular Surgery, Union H osp ital, TongjiM ed ical College, Huazhong Univer sity of Science andTechno logy, Wuhan 43 002 2, China )Abstrac t: Objec tive To investigate the effect o f comprehens ive the rapy fo r Cocke tt syndrom e. Me thods W e re tro spectively com pared and ana ly zed the curative e ffects of com prehensive treatm ents invo lv ing cav a filterp lacem ent, embo lec tom y and venous thrombo lys is on 7 cases of Cockett syndrom e com plicated w ith ph legm asiace rulea do lens ( PCD ) . Results The 7 cases show ed classica l PCD m an ifestations w ith absence of pu lsationo f do rsalis pedis and po ste rio r tib ia l arteries, and the diagnosis o f Cockett syndrom e w ith assoc iated PCD w asconfirm ed by doppler ultrasound A ll cases rece ived em bo lectom y com bined w ith venous thrombo lysis,3 underw ent cava filter p lacement, 3 underw en t Fogarty ca thete r interruption, and 1 underw ent PALMAoperation. After operation, the dorsalis ped is a rtery pu lsation w as resto red, pa in and sw elling d isappea red,and there were no postoperative comp lications in a ll the 7 cases. S ix m onths to three years follow up show edno recurrent thrombosis or other comp lications occarred. Conclusions Com prehensive the rapy w ithintervention procedure, open operation and throm bo lysis fo r treatm ent of Co ckett syndrom e comp licated w ithphlegm asia ce rulea do lens is e ffective and safe, and w ith high short term success rate.[ Chinese Journal of General Surgery, 20 08, 17( 12) : 1210- 1212 ]K ey words: Cockett Syndrom e / ther; Phlegm asia Cerulea Dolens; Cava F ilter; Throm bo ly sis; PALMAOperationCLC number: R 654. 4 Document code: A第12期吴汉青, 等: Cockett综合征合并股青肿的综合治疗分析: 附7例报告 当右髂总动脉横跨左髂总静脉水平时, 由于左髂静脉前方有右髂动脉压迫, 后方又有骶骨岬的前推, 使得左髂总静脉长期受压, 导致左下肢静脉回流障碍和股静脉瓣膜功能不全所引起的一系列临床症状称为左髂静脉受压综合征( ICS ) ,即Cockett 综合征[ 1] 。股青肿( phelegm as ia ceruleado lens, PCD ) 亦称蓝色静脉炎, 是严重的股髂静脉血栓形成后, 肢体高度肿胀压迫动脉引起患肢血供障碍的一种危急重症。临床上Cockett综合征合并股青肿的病例罕见, 我科自1998 年4月 2008 年4 月共收治Cockett 综合征合并PCD患者7 例。分别采用腔静脉滤器置入、球囊导管置入、手术取栓、静脉溶栓等综合治疗, 取得了良好的效果, 现报道如下。1 临床资料1. 1 一般资料及临床表现本组男5 例, 女2 例, 年龄34 ~ 58 (均45)岁。发病时间8~ 49 h, 平均24 h; 均为左下肢发病。表现为左下肢高度肿胀、皮肤青紫、疼痛、皮温下降, 股三角区明显压痛, 表浅静脉怒张, 足背、胫后动脉搏动消失。其中1 例出现足趾处坏疽, 有2 例出现休克体征。血管无创多普勒( PVL ) 检查均示左下肢深静脉无血流, 左侧髂静脉管腔狭窄血流瘀滞。本组术前均诊断为Cockett综合征合并PCD。1. 2 手术方法7 例均经手术治疗。前3 例先行下腔静脉永久性滤器置入术, 均在数字减影血管造影( DSA )室X 线导向下进行操作。硬膜外麻醉后经右侧股静脉穿刺插入导引钢丝, 造影确认下腔静脉受累情况及肾静脉开口位置, 然后在肾静脉开口下方置入下腔静脉滤器。余4例因经济条件放弃腔静脉滤器置入, 而行下腔静脉球囊阻绝术。全麻下先经健侧大隐静脉的1 个分支插入7 号Fogarty 取栓管至下腔静脉, 以便取栓时充盈阻断下腔静脉。其中6例通过用大球囊扩张管扩张左侧髂总静脉汇入下腔静脉的狭窄段, 逐渐加压后狭窄被扩开, 插入7 号Fogarty取栓管可顺利进入下腔静脉并取出大量新鲜血栓。对各股深静脉和股浅静脉内血栓采用Fogarty 取栓加肢体挤压的方法, 尽可能取出血栓。取栓完成后用60 P ro line 无损伤缝线缝合血管壁, 恢复血流。另1 例因大球囊扩张导管插入左侧髂总静脉失败, 术中探查发现整个左侧髂总静脉完全闭塞。该例改行PALMA 手术, 即找出左侧股总静脉, 在股总静脉部位作一纵行切口, 用Fogarty 导管取尽股深静脉和股浅静脉内血栓, 然后将健侧的大隐静脉健侧段游离并切断, 再经耻骨上皮下组织引向患肢, 与左侧股总静脉行端侧吻合, 使患肢的静脉血经健侧的髂静脉向心回流。1. 3 术后处理为了预防术后因血栓形成堵塞回流通道, 手术后采用常规抗凝及溶栓治疗。抗凝药物选用肝素钠1. 25万国际单位( 2 mL ) + 生理盐水48 mL通过静脉泵缓慢推注。为达到更好的抗凝效果,在进行肝素钠静脉泵推注3~ 4d后使用低分子肝素100 IU / kg, 皮下注射, 每12 小时1次。根据国际化标准比值( INR ) 随时调整用量。要求的抗凝效果指标为INR 值达到2. 0 ~ 3. 0。本组患者均采用纤溶酶300 IU + 生理盐水250 mL 静脉滴注, 每天1次。抗凝溶栓治疗期间, 隔日查凝血酶原时间( PT ) 、部分凝血活化酶时间( APTT ) ,每隔30~ 60 m in 观察注射部位有无出血渗漏、皮肤淤斑, 全身有无出血倾向, 如鼻衄牙龈出血﹑便血, 或神志有无异常( 警惕颅内出血的发生) 。共用14 d后改用口服华法林2. 5 mg / d, 维持3 个月以上, 并定期监测凝血功能PT, APTT 及INR 等。2 结 果7例在取栓术中由髂静脉、股静脉、胫后静脉内均取出大量呈条状、松软的血栓, 术毕由静脉远端向近心端通过硬膜外导管注入肝素盐水示下肢静脉已基本通畅。7 例手术均顺利, 无肺栓塞发生, 无死亡。除1 例PALMA 手术外, 6 例术后1 d 足背动脉搏动逐渐恢复, 疼痛消失。术后1周内患肢肿胀消失, 接近术前正常水平, 无截肢, 整个治疗过程中未发生与手术、溶栓有关的严重并发症。术后7 d 血管无创多普勒检查7 例均示左下肢静脉通畅, 动脉搏动良好。术后每3个月随访, 随诊6 个月至3 年未见再次血栓发生, 凝血5 项指标均在控制范围内。3 讨 论左髂总静脉受右髂动脉的压迫致髂静脉内膜发生改变最早由M ay 和Thum er 报告, 之后Cockett等通过静脉造影和手术探查对患有髂股静脉血栓的患者进行研究, 发现髂总静脉除受压外, 静脉内异常结构容易形成血栓, 他们首次提出了ICS的概念, 因此又称Cockett 综合征[ 2] , 其主要临床1211中国普通外科杂志第17卷表现为下肢水肿、浅静脉曲张、皮肤色素沉着或溃疡等[ 3] 。PCD 则是下肢深静脉血栓形成最严重的类型。Cockett综合征的诊断并不困难, 关键是思想上应有所重视。对左下肢深静脉血栓形成的患者, 要考虑到深静脉血栓形成的原因如左髂静脉受压等。要密切观察病情变化, 如果突然出现肢体肿胀加重, 皮肤青紫, 皮温下降, 疼痛, 股三角区明显痛, 表浅静脉怒张, 足背、胫后动脉搏动消失, 患肢深静脉多普勒血流音消失, 即可诊断PCD[ 4] 。静脉造影不应作为常规。因为在严重梗阻的静脉床内, 注入造影剂易加重病情。PCD 一旦确诊, 除用抗凝、祛聚和溶栓疗法外, 应紧急手术取栓以挽救肢体及生命。取栓过程应注意肺动脉栓塞[ 5] , 一旦出现所谓的巨块性肺动脉栓塞, 则病死率很高。本组通过术前放置腔静脉滤器或术中从对侧大隐静脉内插入1 根球囊导管以阻断血流及拦截脱落的血栓从而避免了肺栓塞的发生。1 例近端取栓后, 徐徐退出健侧Fogarty导管时带出1 块近1. 0 cm ! 0. 5 cm !1. 0 cm大的栓子, 说明取栓时如无下腔静脉滤器置入的条件, 采用经健侧大隐静脉置入Fogarty 导管堵塞下腔静脉可同样起到预防肺栓塞的作用。虽然预防性使用下腔静脉滤器的比率逐年增高,但对于手术取栓前是否需要为预防肺梗死而使用下腔静脉滤器, 目前尚有争议[ 6] 。但PCD 型下肢深静脉血栓病情危重, 累及范围广泛, 包括下肢深浅静脉、髂静脉、下腔静脉; 手术并不能取尽血栓, 血栓与血管壁无粘连, 易于脱落, 术后并发肺梗死的可能性大。笔者认为, 在经济容许的条件下行取栓手术前, 最好先行腔静脉滤器植入术, 这样对于术后残余血栓进入下腔静脉可起到很大的预防作用。术后长期坚持抗凝、祛聚治疗对保持患肢静脉通畅防止复发具有重要意义。由于患者处于高凝状态, 术后仍需卧床, 患肢静脉壁可能有炎症反应, 血管内膜不光滑, 血管切口缝合处也不光滑, 存在血栓再形成的可能性[ 7] 。故术后坚持长期( 6个月) 抗凝、祛聚治疗非常重要, 不容忽视。总之, 对Cockett综合征合并PCD 的治疗, 综合应用下腔静脉滤器置入、手术取栓、术后经静脉溶栓等方法, 不仅成功率高, 而且安全可靠。但其确切的疗效仍有待病例积累。本组病例少, 更缺少前瞻性研究, 对于左髂静脉受压狭窄的处理是否需支架植入[ 8] , 远期效果如何尚需进一步探讨和随访观察。参考文献:[ 1 ] Cockett FB, Thom as ML. The iliac com pression syndrom e[ J ] . B r J Su rg, 1 9 6 5, 5 2 ( 1 0 ) : 8 1 6 - 8 2 1.[ 2 ] 张培华. 临床血管外科学[ M ] . 第2 版. 北京: 科学出版社, 2 00 7. 5 5 1 - 5 5 4.[ 3 ] 李晓强, 周为民, 聂中林, 等. 左髂静脉受压综合征的介入治疗[ J ] . 中华放射学杂志, 2 0 0 2, 3 6 ( 3 ) :2 7 4 - 2 7 5.[ 4 ] Squ izzato A, R omuald i E, P ian tan ida E, et a l. Sub cl in icalhypothyroid ism and deep venous th romb os is. [ J ] . Th rom bH aem ost, 2 0 0 7, 97 ( 5 ) : 8 0 3 - 8 1 0.[ 5 ] 杨冬山, 李学锋, 刘汝海, 等. 下肢深静脉血栓取栓术后复发与Cockett综合征的关系[ J ] . 中国普通外科杂志, 2 00 7, 1 6 ( 6 ) : 5 39 - 5 4 1.[ 6 ] K ai R, Im am ura H , Kum azak i S, et a l. T emporary inferiorvena cava f ilter for deep vein throm bosis and acute pu lm on aryth rom boem bolism [ J ] . H eart V essels, 2 0 0 6, 2 1 ( 4 ) :2 2 1 - 2 2 9.[ 7 ] K im H S, Patra A, Paxton BE, et al. Adjun ct ive percu taneou s m echanical thromb ectom y for low er extrem ity deep veinth rom bos is [ J ] . 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72例颈动脉体瘤的诊断和治疗的回顾性分析吴汉青 金毕 吕平 李毅清 欧阳晨曦 夏印 刘建勇 杨超[摘要】目的总结颈动脉体瘤诊断、手术治疗以及并发症防治的经验。方法对我科自1989年2月至2008年2月19年间共收治颈动脉体瘤患者72例(81个)进行回顾性分析。结果采用血管造影术、彩超以及CTA或MRA明确术前诊断。根据瘤体和颈动脉的关系，81个肿瘤均一期切除。其中行单纯瘤体剥除48例(57个)；瘤体连同颈外动脉一同切除5例；瘤体连同部分颈内动脉、颈外动脉，及颈总动脉一并切除后行颈动脉搭桥重建术13例；颈总动脉，颈内动脉吻合2例；颈内动脉结扎术4例。术后15例发生声嘶，8例发生饮水呛咳，经积极治疗后症状消失。3例发生偏瘫，经积极治疗及出院后随访肌力均恢复至两级以上。经5个月至4年随访，8例失访，3例复发，其余无一例手术死亡及其他并发症的发生。结论术前选择性血管造影、CTA或MRA等检查以明确诊断，应尽早手术治疗，根据肿瘤与颈动脉的关系选择适宜术式。手术中脑神经的保护和减少脑缺血时间是预防术后严重并发症的关键。[关键词]颈动脉体瘤； 外科手术； 术中脑保护； 并发症[中图分类号]R739．41[文献标识码]A doi：10．3969／j．isan．1005-6483．2009．03．020Retrospective analysis of the diagnosis and treatment of 72 patients砌th carotidbody tumor WU Han-qing．3lN Bt，Lv P试g，et a1．tDepartment of Vascular Surgery，UnionHospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan430022，China)[Abstract] Objecfive Diagnosis，SUrsical treatment and complication wore summerized inpatients with paragangliomas．Methods A retrospective review was performed on 72 caⅫof carotidbody tumom diagnosed and treated between February 1989 and 2008．Results All carotid body tumorswe／'e confirmed preoperatively by angiography，color Doppler and CTA or MRA．According to the anatomicrelations between tumor body and carotid artery．we primarily resected 81 tumors of which 48 cascs underwontsimple removal，5 cases co—resection of tumor body and carotid artery，13 CaS∞,vaseul&r reconstrnc—tion of carotid artery after eo—resection of tumor body．carotid artery and exterrml carotid artery as well∞common carotid artery，2 cases arterial anastomosis of co／nil'ion carotid artery and internal carotid artery，and 4 caSes ligation of internal carotid artery．After operation，15 caSes developed hoarseness and 8 casesbucking while drinking，and the symptoms disappeared via active treatment．Three developed hemiplegicparalysis，but the muscle force recovered to grade 11 with active treatment．During a follow—up period of5months to 4 years，8 lost contact，3 got relapse，and no death or complications encountered．ConclusionComplete surgical excision was possible for each patient if diagnosis w∞correctly made througIl selec—tive preoperative angiograph．CTA or MRA．The patients with carotid body tumor should be operated as Oarly∞possible with suitable way selected according to the relation between the tumor and the carotid．Thekey to prevent the serious complication is to protect the cerebral nel"ve and diminish the cerebral isehemiatime．[Key words] carotid body tumor； surgery operation； intraoperative protection of brain；complication颈动脉体瘤(carotid body tumor，CBT)是一种少见的、病因不明的、起源于颈动脉体化学感受器的肿瘤，也称化学感受器瘤或副神经节瘤。肿瘤位于颈部，作者单位：430022武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院血管外科临床上易误诊为其他病因所致的颈部包块。由于肿瘤多发生于颈动脉分叉处，手术中可能涉及颈动脉和多组脑神经，术中、术后均可能导致严重的并发症。自1989年2月至2008年2月，我科共手术治疗72例(81个颈动脉体瘤)，现报告如下。临床资料1．一般资料：本组72例，男32例，女40例，男女之比为1：1．25。年龄17—74岁，平均41岁。双侧病变9例，单侧发病63例。病程3个月至30年。术中测量肿瘤体积最大10 cm×6 cm×5 em，最小2 cm×2cm×l cm。全部病例均经病理证实为颈动脉体瘤。本组患者就诊时主要症状为：颈部肿块，部分有头晕、耳鸣、肿物疼痛、偏头疼、音哑、喝水呛咳、呼吸困难、阵发性高血压等症状。门诊误诊为淋巴管瘤、淋巴结结核、神经鞘瘤、转移癌等一共16例，经长期抗结核治疗或抗炎治疗无效，其中7例甚至手术探查，未能切除肿瘤转来我科。2．辅助检查：全部患者均行B超检查，结果提示，81个肿块均为富含血流的实质性肿块。行选择性颈动脉数字减影血管造影(DSA)检查18例，多数结果显示典型的颈动脉体瘤DSA表现一]：①颈动脉分叉处多血管网状、斑片状影，染色早，排空延长至静脉期；②颈外动脉前内移位或前外移位；颈内动脉后外移位，颈动脉分叉角度增大，常引起握球状的特征性改变。此外，DSA还町显示瘤体的滋养动脉。行CTA或MRA的患者44例，均提示肿瘤为富血供型，颈内、颈外动脉分叉角度撑开、增大，与肿瘤形成握球状手术方法。3．治疗：所有病例均采用全身麻醉。行胸锁乳突肌前缘切口，充分暴露并打开颈动脉鞘，以不同颜色的橡皮筋穿绕以标识颈总动脉，颈内静脉，迷走神经和颈内、外动脉，同时备出血时控制动脉出血。所有肿瘤均一期切除，其中行单纯瘤体剥除48例(共57个瘤体)；瘤体连同颈外动脉一同切除5例；其余19例因肿瘤与颈内动脉或颈总动脉紧密粘连无法剥离，故将瘤体连同部分颈内动脉、颈外动脉及颈总动脉一同切除．其中行颈动脉搭桥重建术13例，颈总动脉与颈内动脉直接吻合2例，颈内动脉结扎术4例。切除的肿瘤最小为2．0 cm×2．0 cm×1 cm，最大为10 cm×6 cm×3 till，均由病理证实为颈动脉体瘤。4．结果：所有病例均手术切除，无一例手术死亡。手术切除的81个肿瘤经病理检查证实均为良性。72例患者中获随访64例，随访时间为5个月至10年，8例失访。随访的64例中，3例术后出现偏瘫，其中1例为早年施行颈总动脉结扎+瘤体切除患者，3例患者于术后18个月肌力均恢复至2级以上；15例因喉返神经损伤而出现声嘶，6个月后均恢复正常；4例行颈内动脉结扎者，术后6个月内有头痛头晕感，但未严重影响工作和生活。长期随访复发3例，由于经济原因未再次手术切除。所有随访患者均无其他并发症发生。讨论颈动脉体瘤是一种临床少见的化学感受器肿瘤，该肿瘤通常表现为缓慢生长的颈前三角区肿物，颈动脉向浅侧移位，颈内与颈外动脉分离。临床上除颈部肿物外，一般无其他症状，肿物多位于下颌角处，实性，质地较韧，常触及与颈动脉搏动一致的跳动，肿物受压不缩小或变形，可左右推动，个别患者可闻及血管杂音并触及震颤，由于肿瘤不断生长逐渐压迫或牵拉，一些患者可出现腩缺血表现或颅脑神经受损的表现。1．诊断：颈动脉体瘤大多为良性，恶性病变的发生率约为2％～9％。31。本组81个瘤体，术后病理检查均为良性。根据临床表现及辅助检查，颈动脉体瘤的诊断并不困难，其典型的临床表现为颈部肿块且伴有搏动，但搏动应为传导性而非扩张性。由于肿瘤与颈动脉紧密相连，故颈部肿块只能左右推动而不能上下推动。肿瘤压迫神经时，可出现声嘶或Homer’s征。若仅凭临床表现，有时会误诊为颈淋巴结结核、淋巴结炎、嗜酸性肉芽肿或颁交感神经纤维瘤等，本组误诊16例。因此，诊断颈动脉体瘤还应进行必要的辅助检查，选择性颈总动脉造影为诊断颈动脉体瘤的金标准。血管超声、CT、MRA以及核素显像可作为诊断辅助手段。术前活组织检查可以明确诊断，但常因出血多、对根治手术造成困难，应当尽量少用。我们体会，对颈部尤其是下颌角平面的肿块应想到本病的可能，再结合相应的特殊检查，误诊多可避免。2．分级：Shamblin等。41根据肿瘤侵犯颈内动脉的程度将颈动脉体瘤分为3型：颈内动脉未受累为I型：肿瘤部分包绕颈内动脉包膜为Ⅱ型；肿瘤包绕颈内动脉并与管壁粘连为Ⅲ型。其根据检查结果并结合临床，认为病变局限在颈动脉分叉内，而颈动脉外形正常与Shamblin I型相对应；病变稍越出动脉边界，颈内、外动脉轻度移位与Shamblin II型相对应；瘤体明显越出移位的动脉边界，且管腔不规则与Shamblin llI型相对应。按Shamblin分型方法，本组72例患者中48例属I型，属Ⅱ型者9例，其余15例为Shamblin lU型。3．治疗：颈动脉体瘤一旦确诊，应尽早手术治疗，手术切除是颈动脉体瘤最有效也是唯一的治疗方法。一般主张诊断明确后应尽早手术。病程愈长，与动脉的粘连愈紧密，从而增加手术切除的困难，损伤颈动脉的可能性也愈大。应根据肿瘤与颈动脉的关系选择适宜术式。其手术方法包括剥除术、肿瘤连同受累血管切除(不作颈动脉重建)和肿瘤、受累动脉切除后即刻颈动脉重建术。近年来不少学者提倡，只要条件具备，应立即行颈动脉重建。①瘤体剥离术：病变早期，瘤体在颈动脉外鞘内生长，但与颈动脉的粘连不甚紧密，容易分离切除。本组48例57个瘤体采用此术式，其中5例，瘤体虽然已将颈内动脉包绕，但仍能剥离切除。②颈内动脉结扎术：由于病程太长或肿瘤已恶变，肿瘤已与颈内动脉紧密粘着，勉强剥离可能损伤颈内动脉。本组患者中有l例，病程长达10年，就诊时发现肿瘤有10 cm×6 em×5 O,m大，并压迫颈交感神经引起Homer’s征。手术时发现肿瘤与颈内动脉紧密粘连，而且颅外颈内动脉已无正常可供搭桥的血管，故只能作颈内动脉远端结扎，近端颈内动脉与部分颈总动脉连同肿瘤一并切除。由于该患者的颈内动脉已被肿瘤压迫闭塞，患侧脑供血已由对侧代偿，故术后仅感头痛和头晕，未出现脑缺血症状。③瘤体同部分颈内动脉和颈总动脉一并切除，颈总动脉颈内动脉搭桥术：当肿瘤与颈总动脉及颈内动脉紧密粘连，颅外颈内动脉仍有叮供搭桥的血管时，可将瘤体连同部分颈内动脉和颈总动脉一并切除，人造血管或自体大隐静脉作颈总动脉颈内动脉搭桥术重建脑血供。本组患者中13例作了动脉重建搭桥手术，其中6例使用人造血管，7例使用自体大隐静脉。13例术后均未出现脑缺血症状，随访3个月至10年，无一例出现中风或脑缺血。④瘤体连同颈总动脉一并切除：颈动脉结扎术有时是必要的，对局部晚期患者，瘤较大，上界较高，甚至深入颌骨或后咽旁间隙，颈内动脉的出颅段仅供止血钳夹得少许断端，无条件移植。本组3例肿瘤巨大，侵犯颈内动脉达颅底，颈总动脉已受侵犯并完全闭塞，行颈总动脉结扎后将肿瘤连同颈动脉分叉一并切除，术后出现偏瘫，经积极治疗随访后肌力均恢复至二级以上。4．术后并发症的防治：颈动脉体瘤手术后，主要是防止大出血及脑血管梗死发生。对于行颈动脉重建或修补的患者，应特别注意术后大出血；对于行颈内动脉结扎的病例，更应注意脑血管梗死的发生"J，因为颈内动脉远端形成的血栓可以逐渐向上蔓延扩大，也可脱落，造成严重后果，甚至危及生命。即使是单纯剥除肿瘤的患者，也可因颈动脉受手术干扰发生痉挛而导致脑血管梗死。因此我们术后密切观察病情，测定血压、脉搏、呼吸，尤其注意有无神志、四肢运动障碍等脑缺血反应。术后2周内避免颈部的剧烈活动，并预防性的使用低分子肝素及活血化瘀药如灯盏细辛等。参考文献[1]李滨，陈福真，苏旭，等．34例颈动脉体瘤的治疗体会[J]．中华普通外科杂志，2005，20(5)：312-313[2】邻敬才．苟文必，张怡，等彩色超声多普勒、DSA在颈动脉体瘤和神经鞘瘤诊断与鉴别诊断中的应用[J]．中国口腔颌面外科杂志，2006，4(6)：449-452．[3]Paeheeo—ojeda L．Malignant carotid body tumon：report of three cas∞[J]．Ann Otol Rhinol Laryn901．2001．1 10(I)：36枷．[4】Shamblin WR．ReMine WH．Sheps SG．et a1．Carotid body tumor(ehe．modeetoma)．Clinicopathologie analysis of ninety ca∞9[J]．Am J Surg．】97I．122(6)：732-739．[5]Tfipp HF。Fail PS，Beyer MC．et a1．New approach to preoperative vfl．flcularexclusionfor carotid bodytumor[J]．J Vase Surg，2003，38(2)：389-391[作者简介]吴汉青(1983一)，男，博士。(收稿13期：2008-06-26)

I125粒子植入在胰腺恶性肿瘤治疗中的疗效分析吴汉青, 吴河水, 杨智勇, 王春友, 原伟伟吴汉青, 吴河水, 杨智勇, 王春友, 原伟伟, 华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心 湖北省武汉市 430022作者贡献分布: 吴汉青与吴河水对此文所作贡献均等; 此课题由吴汉青、吴河水、杨智勇、王春友及原伟伟设计; 研究过程由吴汉青、吴河水及王春友操作完成; 数据分析由吴汉青、吴河水及杨智勇完成; 本论文写作由吴汉青与原伟伟完成.通讯作者: 吴河水, 教授, 博士生导师, 430022, 湖北省武汉市,华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心.whs1898@public.wh.hb.cn电话: 027-62710555收稿日期: 2009-07-16 修回日期: 2009-09-09接受日期: 2009-09-15 在线出版日期: 2009-10-08Efficacy of iodine-125 seedimplantation in pancreaticcarcinomaHan-Qing Wu, He-Shui Wu, Zhi-Yong Yang,Chun-You Wang, Wei-Wei YuanHan-Qing Wu, He-Shui Wu, Zhi-Yong Yang, Chun-YouWang, Wei-Wei Yuan, Pancreatic Surgery Center, WuhanUnion Hospital, Tongji Medical College of Huazhong Universityof Science and Technology, Wuhan 430022, HubeiProvince, ChinaCorrespondence to: Professor He-Shui Wu, PancreaticSurgery Center, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan430022, Hubei Province,China. whs1898@public.wh.hb.cnReceived: 2009-07-16 Revised: 2009-09-09Accepted: 2009-09-15 Published online: 2009-10-08AbstractAIM: To investigate the efficacy of palliativeoperation in combination with iodine-125(I-125) seed implantation and postoperativechemotherapy in the treatment of unresectablepancreatic carcinoma.METHODS: A total of 149 pancreatic carcinomapatients were retrospectively analyzed. Thesepatients were divided into two groups accordingto therapeutic protocol: patients undergoingpalliative operation in combination with postoperativechemotherapy and I-125 seed implantation(study group, n = 62) and those undergoingpalliative operation only in combination withpostoperative chemotherapy (control group, n =87). Objective tumor response, clinical benefit response,median survival time and complicationrate were compared between the two groups.RESULTS: Significant differences were notedin clinical benefit response and median survivaltime between the two groups (χ2 = 7.361 and10.090, respectively, both P < 0.05). No significantdifferences were observed in objective tumorresponse and complication rate between thetwo groups (both P > 0.05).CONCLUSION: Palliative operation in combinationwith I-125 seed implantation and postoperativechemotherapy is safe and effective inthe treatment of unresectable pancreatic carcinoma.Key Words: Pancreatic carcinoma; Palliative operation;Iodine-125 seed implantation; PostoperativechemotherapyWu HQ, Wu HS, Yang ZY, Wang CY, Yuan WW. Efficacyof iodine-125 seed implantation in pancreatic carcinoma.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2009; 17(28): 2951-2954摘要目的: 分析姑息性手术联合I125粒子植入和化疗对晚期胰腺癌患者的疗效.方法: 回顾性分析我科2004-2008年收治的晚期胰腺癌患者149例, 按治疗方法分为2组, 姑息手术+I125粒子植入+化疗62例(A组), 姑息手术+化疗87例(B组). 比较2组患者客观有效率(OTR)、临床受益率(CBR)、中位生存期以及并发症发生率.结果: 与B组相比, A组患者临床受益率, 中位生存期差异有统计学差异(χ2 = 7.361, 10.090,P 0.05).结论: 姑息性手术联合I125粒子植入和术后化疗治疗晚期胰腺癌患者, 是一种安全有效的治疗方法.关键词: 胰腺肿瘤; 姑息手术; I125粒子植入; 术后化疗吴汉青, 吴河水, 杨智勇, 王春友, 原伟伟. I125粒子植入在胰腺恶性肿瘤治疗中的疗效分析. 世界华人消化杂志 2009; 17(28):2951-2954http://www.wjgnet.com/1009-3079/17/2951.asp0 引言胰腺癌因其隐匿性及生物学特性, 患者早期多无明显临床症状, 就诊时大多失去根治性切除机会. 对于不能行根治切除的中晚期胰腺癌, 治疗方法较多, 但效果不尽人意[1]. 华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心自2004年采用姑息性手术联合I125粒子植入和术后化疗治疗患者, 取得了较好的疗效, 现报道如下.1 材料和方法1.1 材料 收集2004-01/2008-06华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科收治的中晚期胰腺癌患者149例, 患者术前均经彩超和CT, 或者经术中病理确诊肿瘤已广泛侵犯肠系膜血管和(或)门静脉血管, 无法施行根治性手术. 其中男91例, 女58例, 年龄31-72(平均52)岁; 既往未接受化疗和放疗, 无严重的心脏病及其他脏器病史等.1.2 方法1.2.1 分组: 根据患者所受的治疗方法分为2组,A组62例, 行姑息性手术(如胆管空肠吻合和/或胃空肠吻合等), 术中同时在肿瘤中植入I125粒子,术后行化疗(吉西他滨); B组87例, 行姑息性手术(同A组), 术后行化疗(同A组). 2组病例性别、年龄和病程方面无差异, 具有可比性.1.2.2 治疗: 手术前彩超和CT检查结果评价瘤体,根据胰腺肿瘤病灶大小、位置以及与周围正常组织的关系从而确定手术方案及I125粒子植入的数目及进针的深度. I125粒子植入是在术中直视下采用粒子植入枪植入, 常用的粒子数目估算公式为: 粒子植入总数 = [(肿瘤长+宽+高)/3×5]/每个粒子的活度, 常用的每个粒子的活度为(1.1-1.8)×107 Bq, 一般粒子数目为20-40粒. 姑息性手术常常为胆管空肠吻合和/或胃空肠吻合术, 其目的常常为解除黄疸及肠道梗阻. 吉西他滨的化疗常常在患者术后2 wk内施行, 用量根据患者体表面积大小决定常常为1000 mg/m2经外周静脉滴入30 min, 每周1次, 连续3 wk, 随后休息1 wk, 每4 wk重复1次. 依据患者的毒性反应相应减少剂量.1.2.3 临床疗效标准和临床受益反应: 临床疗效标准按照世界卫生组织(WHO)疗效评价标准,将患者治疗疗效评价为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD). 临床受益反应根据1997年Burris et al 制定的临床受益反应标准对患者的疼痛强度对患者的疼痛强度(VAS评分, 10分制)、镇痛药物消耗量、卡氏评分和体质量变化综合评估. 凡符合下列一项指标(持续4 wk以上), 并无任何一项恶化者, 定义为临床受益者: (1)疼痛强度减轻≥50%; (2)镇痛药物用量减少≥50%; (3)体力状况按卡氏评分标准改善≥20分; (4)如疼痛程度及体力状况均稳定, 则非体液滞留的体质量增加≥7%.统计学处理 在SPSS13.0软件上进行统计学分析, 2组间样本客观有效率, 临床受益率以及并发症发生率等采用χ2检验. 对生存率比较采用Log-rank检验法. P 梗阻性黄疸. 手术方式有胆囊空肠吻合、胆管空肠吻合和胆道外引流等. 本次收集的患者中, 有黄疸者82例, 占所有患者比例为55%. (2)解除或预防十二指肠梗阻: 手术方式通常为胃空肠吻合,对尚未发生梗阻行预防性胃空肠吻合尚存在争议. 本次患者中有十二指肠梗阻者9例, 占所有患者比例为6%, 对其他患者未行预防性胃空肠吻合. (3)缓解疼痛: 引流减压胆胰管; 内脏神经切断或神经节切除等. 放射性粒子近距离治疗肿瘤是指将微型放射源(I125放射性粒子)植入肿瘤内或受肿瘤浸润侵犯的组织中, 包括肿瘤淋巴扩散途径的组织, 通过微型放射源发出的持续低能量射线, 使肿瘤组织遭受最大程度的毁灭性损伤, 而正常组织不损伤或仅有微小损伤.肿瘤的内部放射治疗既能达到一定治疗效果,同时也无严重并发症. 据文献报道, I125内放射粒子植入可有力控制胰腺癌局部病变的发展, 降低肿瘤生长速度. 与此同时, 内放射粒子副损伤小, 可有力保留周围功能性组织(如血管和神经等)[7]. 从上述实验结果可以看出, 通过放射性粒子植入治疗中晚期手术不能切除的胰腺癌病例,可以明显改善生活质量减少患者尤其是疼痛对患者的影响, 同时不引起明显并发症. 结果说明粒子植入有比较确切的止痛效果, 可以明显改善患者的生活质量. 本实验A组患者行粒子植入后, 对比B组未行粒子植入患者, 生活质量明显改善, 这可能与减轻患者疼痛有关. 吉西他滨对胰腺癌的治疗作用最早在1999年Storniolo et al [8]一项临床试验, 证实了吉西他滨对晚期胰腺癌的治疗益处. 此后吉西他滨成为晚期胰腺癌的标准一线药物, 并逐渐用于术后治疗. 近年的研究多针对吉西他滨为基础的化疗方案. 而吉西他滨作为新合成的脱氧胞苷类似物, 具有完全不同的抗肿瘤活性, 美国FDA以批准吉西他滨作为抗胰腺癌的一线用药[9], 在无法行根治切除术的进展期胰腺癌患者, 吉西他滨可以获得较高的反应率和更长的生存期. 在2007年ASCO年会上, Yoshitomi et al [10]报道了胰腺癌术后辅助化疗的Ⅱ期随机临床试验结论是吉西他滨为基础的联合化疗方案对术后患者是安全有效的.本研究结果显示对肿块不能切除、伴有消化系梗阻的晚期胰腺癌患者, 在应用姑息手术以解除日渐加重的胆道和胃肠道梗阻的基础上,结合术后吉西他滨化疗加行术中I125粒子植入可明显提高晚期胰腺癌患者的客观有效率和临床受益率. 同时结果显示I125粒子植入组临床受益率明显高于未加用粒子组, 说明I125粒子植入可持久的改善患者生活质量, 减轻痛苦, 这可能与I125粒子既可以使肿瘤局部变性坏死, 减轻局部张力, 也可以破坏胰腺周围的腹腔神经丛有关.在并发症的发生率上, I125粒子植入组并发症发生并没有高于未植入粒子组, 这说明在粒子植入对于患者是比较安全的. 在生存率的比较上,I125粒子植入组与未植入组有明显的统计学差异,所以粒子的植入能够提高患者的远期生存率,这可能与I125粒子的放射性能够局部杀灭肿瘤细胞, 抑制肿瘤的生长, 从而提高患者中位生存期.但I125粒子种植治疗也有其不利的因素, 如粒子游走等. A组患者有1例患者出现粒子游走至肝脏, 但因患者无不良反应, 肝功能正常未作处理.由于I125的半衰期特点以及穿透力的局限性, 目前许多学者正进行更具优越性的Pd103粒子治疗胰腺癌的探讨, 如Bernard et al [11]应用Pd103粒子治疗一组晚期胰腺癌患者, 但确切疗效尚需要大样本资料对照研究来证实.总之, 姑息性手术联合I125粒子植入和吉西他滨化疗对局部进展期胰腺癌, 能控制局部肿瘤的生长, 提高患者生存率, 是一种安全有效的晚期胰腺肿瘤治疗手段.4 参考文献1 Cooperman AM, Kini S, Snady H, Bruckner H,Chamberlain RS. Current surgical therapy forcarcinoma of the pancreas. J Clin Gastroenterol 2000;31: 107-1132 Parkin DM, Bray FI, Devesa SS. Cancer burden inthe year 2000. The global picture. Eur J Cancer 2001;37 Suppl 8: S4-S663 Haller DG. New perspectives in the management ofpancreas cancer. Semin Oncol 2003; 30: 3-104 Willett CG, Safran H, Abrams RA, Regine WF,Rich TA. Clinical research in pancreatic cancer: theRadiation Therapy Oncology Group trials. Int JRadiat Oncol Biol Phys 2003; 56: 31-375 Moore MJ. Pancreatic cancer: what the oncologistcan offer for palliation. Can J Gastroenterol 2002; 16:121-1246 B t t g e r T C , J u n g i n g e r T . F a c t o r sinf luenc ing morbidi ty and mor tal i ty af terpancreaticoduodenectomy: critical analysis of 221resections. World J Surg 1999; 23: 164-171; discussion171-1727 Cooperman AM. Pancreatic cancer: the biggerpicture. Surg Clin North Am 2001; 81: 557-5748 Storniolo AM, Enas NH, Brown CA, Voi M,Rothenberg ML, Schilsky R. An investigationalnew drug treatment program for patients withgemcitabine: results for over 3000 patients withpancreatic carcinoma. Cancer 1999; 85: 1261-12689 Oya N. Chemoradiotherapy for pancreatic cancer:current status and perspectives. Int J Clin Oncol2004; 9: 451-45710 Yoshitomi H, Togawa A, Kimura F, Shimizu H,Yoshidome H, Miyazaki M. A randomized phase IItrial of adjuvant chemotherapy with uracil/tegafur(UFT) and gemcitabine (GEM) vs gemcitabine alonein patients with resected pancreatic cancer. ASCOAnnual Meeting, 2007: Abstract 45411 Bernard S, Vynckier S. Dosimetric study of a newpolymer encapsulated palladium-103 seed. PhysMed Biol 2005; 50: 1493-1504

TLR9在胰腺癌中的表达及临床意义吴汉青朱世凯 张建军 杨智勇 王春友 吴河水*【摘要】目的 检测TLR9在胰腺癌组织中的表达，探讨其临床意义。方法 采用实时定量PCR法、免疫印迹及免疫组织化学方法检测30例胰腺癌组织及其相近癌旁组织、10例正常胰腺组织中TLR9的表达，并分析胰腺癌组织中TLR9的表达与病理分级、临床分期及转移的关系。结果 胰腺癌TLR9mRNA扩增倍数值为2.32(1. 41~3.22)，癌旁组织为1.23 (1.18~1.28)，两组表达有显著差异(t=2.642, P=0.023)。胰腺癌TLR9蛋白阳性表达率为73.3%，癌旁组织为33.3%，正常胰腺组织为20%，呈递减趋势(c2 =13.99, P=0.001)。胰腺癌TLR9高表达和肿瘤分化成度、TNM分期、淋巴结转移呈正相关。Western blot结果与免疫组织化学一致，灰度分析结果显示差异显著。 结论 TLR9在胰腺癌组织中高表达,且TLR9表达与肿瘤分级有关 ,提示可能通过免疫机制参与胰腺癌的发生、发展过程。【关键词】胰腺肿瘤，癌，TLR9TLR9 expression in pancreatic cancer and its clinic significanceHan-Qing Wu, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Zhi-Yong Yang, Chun-You Wang, He-Shui WuDepartment of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,ChinaCorrespondence to: Professor He-Shui Wu, Email:heshuiwu@163.com.[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer, and to explore their clinical significance. Methods: The real-time RT-PCR technique, western blot method and immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 in the pancreatic cancer, tissues near tumor, and normal pancreatic tissues which obtained during operation from 30 pancreatic carcinoma patients and 10 normal non-lump patient. The relationships with pathological grade, clinical stage, and metastasis of pancreatic cancer were statistically analyzed. Results The amplification value level of TLR9mRNA expression in human pancreatic tissues, paracancerous tissues were 2.32（1.41~3.22）and 1.23（1.18~1.28），respectively（t=2.642,p=0.023）.The percentage of positive cells expressed TLR9 protein in human pancreatic tissues, paracancerous tissues and normal tissues were 73.3%, 33.3% and 20.0%,the protein expression level of TLR9 was gradually descending(c2=13.99,P=0.001). The highly expressed TLR9 correlated significantly with the degree of tumor differentiation、an advanced TNM stage and lymph node metastasis. Similar result was obtained by Western blot.Conclusions: TLR9 has a higher expression in pancreatic cancer tissues. TLR9 expression has a close relationship with pathological grades of pancreatic cancer, suggesting that TLR9 play an important role in the development and progression of pancreatic cancer through immunologic mechanism.[Key Words] Pancreatic neoplasms; Cancer; Toll-like receptor 9Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是一新发现的古老的受体家族，不仅是参与天然免疫的重要受体，而且与特异性免疫、免疫耐受和某些疾病防治密切相关。近来发现toll样受体可能参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程[1]。而TLR9为该家族重要成员，能够刺激B细胞和树突状细胞分泌大量的细胞因子和趋化因子，如白介素(IL)-12、IL-6、干扰素-γ、单核细胞抑制蛋白和金属基质蛋白酶的表达[2]。很多肿瘤都出现TLR9高表达现象，但TLR9是否与胰腺癌的发生，发展有关，目前尚不清楚。本研究旨在通过观察胰腺癌中TLR9的表达情况，探讨其与胰腺癌发生发展的关系，并探讨其临床意义，以期为胰腺癌的治疗提供新的依据。资料与方法一 、临床病理学资料30例人新鲜胰腺癌组织及相应的癌旁组织（据肿瘤边缘1-2cm）取自胰腺癌患者、10例正常胰腺组织标本取自其他原因需行胰腺部分切除的非肿瘤患者，所有标本均为华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心2008年12月至2009年8月接受手术治疗的胰腺癌患者且经术后病理证实，术前未行放疗及化疗。标本均在手术切除后立即采集，一式两份，一份立即放入液氮中，然后置于-80℃保存备用。另一份用10%甲醛固定后用石蜡包埋，用以免疫组织化学分析。40例患者中男性19例，女性11例，年龄39～75岁，平均年龄57岁。肿瘤组织病理分级：高分化12例，中低分化18例。 淋巴结转移10例，未转移20例。二、实时定量PCR检测TLR9基因表达情况参照Trizol试剂盒(sigma公司)说明书提取组织总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，然后用ReverTra Ace（Toyobo公司）逆转录合成cDNA。引物设计根据GenBank人TLR9mRNA序列，TLR9引物序列上游为：5-GCCCAAATCCCTCATATCCC-3，下游为：5-AACAGTTGCCGTCCATGAATAG-3,扩增产物为113bp。内参照物β-actin的引物，上游为：5-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3，下游为：5-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3，扩增产物为190bp（上海生工技术服务有限公司）。采用实时定量 PCR（SYBR GREEN）法检测TLR9mRNA。扩增曲线反应程序：50℃ 2min，95℃ 2min，然后95℃变性15s，退火15s，延伸72℃ 45s，共40个循环。后72℃延伸10min终止反应。PCR仪为HONGSHI公司的SLAN Real-time PCR Detection System。胰腺癌或相应的癌旁组织以及10例正常胰腺组织的△CT=CT(目的基因)-Ct(β-actin), △△CT=△CT实验-△CT对照, 我们以10例正常胰腺组织的△CT均值作为对照，通过计算得到扩增倍数=2-△△CT。三、免疫印记检测TLR9蛋白表达情况常规方法进行组织蛋白提取，考马斯亮蓝法测蛋白浓度。取15μl蛋白进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉封闭非特异性抗原，加入1：750稀释的兔抗人TLR9单克隆抗体(cell signaling公司)，4℃孵育过夜，用含0.1％Tween20的TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗，室温孵育2 h，洗膜后加入增强化学发光底物EcL Plus试剂，曝光于x胶片上，曝光时间为30 s，常规显影，定影。采用自动电泳凝胶成像分析软件(Band scan v5.0)进行图像扫描和分析。四、免疫组织化学检测TLR9蛋白表达情况采用免疫组织化学SP(streptavidin-perosidase)法，参照免疫组织化学试剂盒(武汉博士德公司)说明书进行。以已知TLR9阳性的肺癌组织[3]切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察细胞染成棕黄色者为阳性，着色物质呈颗粒状或片状，主要存在于肿瘤细胞胞浆内。染色结果通过双盲评价，随机观察10个高倍视野，避开肿瘤边缘及坏死区域，根据显色强度和着色百分数进行半定量分析，依细胞阳性着色程度分为：阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分。依着色阳性百分比分为：未染色为0分，阳性细胞总数<25%为1分，阳性细胞在25%-49%为2分，阳性细胞总数在50%以上为3分。将两个分值相加，0～1分为阴性（–），2～3分弱阳性（﹢），4～5分为阳性（﹢﹢），5分以上为强阳性（﹢﹢﹢）。（﹢﹢）与（﹢﹢﹢）为高表达，（–）与（﹢）为低表达。五、统计学方法 采用 SPSS 13.0 统计分析软件，应用t检验、χ2检验、 Fisher 精确概率法及秩和检验作数值间的差异和相关性分析。以α=0. 05为检验水准，P<0.05为差异有统计学差异。结 果1 实时定量PCR结果正常胰腺组织、胰腺癌组织和癌旁胰腺组织中均有TLR9mRNA和β-actin mRNA的表达。以正常胰腺组织中TLR9mRNA作为对照，胰腺癌TLR9mRNA的扩增倍数值为2.32（1.41~3.22）,癌旁组织为1.23（1.18~1.28），两组表达差异显著（t=2.642，p=0.023）。2免疫印迹结果 由图1可见，癌及癌旁组织以及正常胰腺组织内均有内参GAPDH蛋白的表达，蛋白条带位置为36 kDa，TLR-9的表达位置在130 kDa。TLR9在癌组织中的表达量明显高于相应的癌旁组织及胰腺正常组织。图1 TLR-9蛋白质免疫印迹结果（1：正常胰腺，2：癌旁胰腺组织，3胰腺癌组织）3免疫组化结果TLR9蛋白主要表达于癌细胞的胞浆内，呈棕黄色或棕褐色，染色均一；癌旁组织及正常胰腺组织的胞浆中也可见到TLR9蛋白表达，但呈浅黄色且较胰腺癌组织少(图2)。TLR9在正常胰腺组织、胰腺癌旁组织和胰腺癌组织中的阳性表达率分别为20％(2/10)、33.3％(10/30)和73.3％(22/30)，各组之间差异有显著性统计学意义(χ2=13.99，P=0.001)（表1）。正常胰腺组织中TLR9未见高表达，而胰腺癌组织中TLR9蛋白高表达占73.3％(22/30)。从正常组织、癌旁组织到胰腺癌组织，TLR9的阳性表达率呈递增趋势。30例胰腺癌癌组织中TLR9蛋白的高表达与肿瘤的部位以及肿瘤大小无关(P>0.05)，而与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05，表2)。图2 TLR9蛋白在胰腺癌组织、癌旁胰腺组织及正常胰腺组织中的表达（×200）；胰腺癌组织（A），癌旁胰腺组织（B），正常胰腺组织（C）表1 TLR9蛋白正常、癌旁和胰腺癌组织中的表达情况组别例数TLR9蛋白阳性阳性率（%）阳性阴性正常组织癌旁组织胰腺癌组织10303022022810820.033.373.3表2 胰腺癌组织中TLR9高表达与病理参数的关系临床特征例数TLR9高表达阳性TLR9高表达阴性阳性率（%） P值肿瘤部位 胰头部 胰体尾部20101575375.0%70.0%1.00肿瘤大小 ≤3cm >3cm17131394476.5%69.2%0.68分化程度 高分化中低分化12186166250.0%88.9%0.034TNM分期 –П Ш-13167156153.8%93.8%0.026淋巴结转移 无 有20101397165.0%90.0%0.024注：应用χ2检验、Fisher精确概率法进行统计学分析讨 论 TLRs是新近发现的病原模式识别受体，能够识别特定类型微生物的保守分子成分，即病原体相关分子模式(pathogen—associated molecular patterns，PAMPs)。1997年Medzhitov[4]等首次发现了人类的第一种Toll同源变体(即TLR4)，后又发现并确认了10种人的TLR家族蛋白，分别被命名为TLR1-TLR11。其中TLR9是TLR家族的重要成员，其特异性识别的PAMPS为细菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的寡脱氧核苷酸(CpG—oligodeoxynucleotides，CpG-ODN)[5]，TLR9在介导外源CpG DNA激活先天免疫过程中有重要的生物学意义。TLR9除了抗感染作用,还与自身免疫紊乱、恶性肿瘤的发生相关[6]。有研究表明，由TLRs包括TLR9诱导的信号通路可能在肿瘤形成过程中起着重要作用，TLRs表达的上调与胃癌、肠癌、肺癌等发生、发展可能有密切关系[7]。同时研究还发现TLR9在肿瘤上的表达可为肿瘤的化疗、免疫治疗提供新方法。但目前对于TLR9在胰腺癌中的表达及作用了解甚少。本研究对胰腺癌肿瘤组织内的TLR9在基因水平和蛋白水平以及TLR9蛋白大小都作了检测，并和癌旁胰腺组织及正常胰腺组织进行对比，在基因水平上结果发现胰腺癌组织、癌旁胰腺组织及正常组织中均有TLR9mRNA的表达，但癌组织的表达最高，显著高于非癌组织(P<0.05)。在免疫组化染色图片上，发现TLR9主要在胰腺癌的胞浆细胞中表达，并且胰腺癌组织中TLR9阳性表达率明显高于胰腺癌旁组织和正常胰腺组织，这与Droemann[3]在肺癌中的研究呈正相关结果一致。胰腺癌组织中TLR9的高表达与患者的年龄、性别、肿瘤的部位以及大小无关，而与肿瘤分化程度、TMN分期、淋巴结转移或远距转移有关，提示TLR9受体不仅参与正常胰腺组织的生长和发育等生理功能，也参与胰腺组织的恶性转化过程。Schmausser[8]等的研究证实TLR9与其他TLRs共同参与胃癌的发生。本研究结果与其一致。近年大量研究证实，CpG ODN具有很强的Th1方向的免疫凋节作用，主要是通过与TLR9结合，诱导分泌IFN-7、IL-12等Th1极性的细胞因子，促进Th0细胞向Th1方向分化。如CpG DNA通过序列非依赖性受体介导的内吞作用进入树突细胞，在溶酶体区域与TLR9特异性作用，然后通过IRAK1、IRF7、TRAF6、MAPK、核因子-KB(NF-KB)途径及衔接子MyD88激活下游信号通路[9]。通过下游信号通路最终导致类浆细胞树突细胞的活化并成熟为专职抗原提呈细胞。这些成熟的抗原提呈细胞表面表达共刺激分子(CD80、CD86)、趋化因子受体CCR7，分泌Th1型细胞因子，活化NK细胞[10]，由于中性粒细胞表面Fc受体表达的增加，细胞毒活性增强，从而进一步引起更多类浆细胞、树突细胞活化成熟、抗原提呈。通过CpG与TLR9的作用，抗原提呈细胞如Dc细胞可以交叉提呈外源性抗原，从而交叉激活CD8+T细胞、NK细胞、巨噬细胞的活化，产生Th1型的免疫反应，激活天然免疫反应[11]。而目前CpG ODN作为免疫佐剂通过TLR-9诱导强的Thl型免疫应答在人肺腺癌A549细胞上，可能作为单一治疗或者免疫治疗的辅助治疗应用于肿瘤的治疗[12]。综上所述，TLR9在胰腺癌组织中的高表达提示其有可能成为肿瘤治疗的一个新的干预靶点。TLR9蛋白的表达与胰腺癌细胞的恶性程度有关，亦与胰腺癌是否有淋巴结转移有关，这为胰腺癌的治疗及预后判断提供了参考依据。运用 TLR9的相关配体CpG ODN对胰腺癌进行免疫治疗可能为胰腺癌治疗提供了新的治疗可能。参考文献1. Jurk M, Vollmer J. Therapeutic Applications of Synthetic CpG Oligodeoxynucleotides as TLR9 Agonists for Immune Modulation[J]. BioDrugs,2007;21(6):387-401.2. Theiner G, Rossner S, Dalpke A, et al.TLR9 cooperates with TLR4 to increase IL-12 release by murine dendritic cells[J]. Molecular Immunology,2008;45(1):244-252.3. Droemann D, Albrecht D, Gerdes J ,et al. Human lung cancer cells express functionally active Toll-like receptor 9[J]. Respir Res,2005,6(1):1-10.4. Medzhitov R, Preston - Hurlburt P, Janeway CA. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J]. Nature, 1997, 388: 394–397.5. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA[J]. Nature,2000, 408(6813) :740.6. Ishii KJ, Akira S. Innate immune recognition of, and regulation by, DNA[J]. Trends Immunol，2006 Nov;27:525-532.7. Coussens LM , Werb Z. Inflammation and cancer[J] . Nature , 2002; 420 (6917): 860-867.8. Schmauber B，Andrulis M，Endrich S, et al. Toll-like receptors TLR4, TLR5 and TLR9 on gastric carcinoma cells: An implication for interaction with Helicobacter pylori[J]. Med Microbio, 2005,295(3):179-185.9. Underhill DM. Toll - like receptors : networking for success[J]. Eur J Immunol , 2003 ,33 (7) :1767.10. Ballas Z. Modulation of NK cell activity by CpG oligodeoxynucleotides[J]. Immunol Res,2007;39(1-3):15-21.11. Krieg AM. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation[J]. Nat rev drug disc, 2006,5:471-484.12. Krieg AM. Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer[J]. Oncogene, 2008; 27:161-167.本文发表在《中华胰腺病杂志》2011年第三期，请查看原文本课题受国家自然科学基金资助（基金编号：30200272）作者简介：吴汉青，男， 在读博士，主要从事胰腺肿瘤方面的研究。E-mail:wuhanqincat@163.com通讯作者：吴河水，教授，博士生导师，武汉 430022，华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心；Email:heshuiwu@163.com.

吴汉青 王博 朱世凯 张建军 王春友 吴河水*【摘要】目的 检测TLR9在人胰腺癌及胰腺癌细胞中的表达，研究CPG ODN2216对Panc-1细胞生物学行为的影响，并探讨其临床意义。方法 通过免疫组织化学方法确认TLR9蛋白在胰腺癌组织中的高表达，免疫荧光确认其在胰腺癌细胞株Panc-1中的高表达。通过细胞粘附、划痕实验、侵袭实验、细胞克隆及MTT增值实验，研究CPG ODN2216对细胞粘附力、活动力及增殖力的影响。结果 人胰腺癌标本及人胰腺癌细胞株Panc-1均高表达TLR9。划痕实验、体外粘附实验、基质胶侵袭实验、细胞克隆实验证明CPG ODN2216实验组细胞粘附力及活动力明显低于未加序列对照组。MTT法检测序列组增殖力明显低于未加序列对照组，且增值活性具有时间剂量依赖性。结论TLR9基因与人类胰腺癌的侵袭转移潜能相关，外源配体CPG ODN2216的使用可明显抑制人类胰腺癌细胞Panc-1的侵袭、迁移能力。【关键词】CPG ODN2216, 胰腺肿瘤, Toll样受体9,细胞生物学Influence of CPG ODN down-regulation on biology of pancreas cell line PANC-1 and the expression of TLR9 in human pancreatic cancerHan-Qing Wu, Bo Wang, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Chun-You Wang, He-Shui WuDepartment of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,ChinaCorrespondence to: Professor He-Shui Wu, Email:heshuiwu@163.com.[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer and investigate the effect of CPG ODN2216 on biological behavior of the pancreatic cell carcinoma, and to explore their clinical significance. Methods: The immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 protein in the pancreatic cancer tissue and immunofluorescence staining was also performed to detect the TLR9 protein expression in pancreatic carcinoma cells．In vitro cell adhesion, Wound-healing scrape assay, transwell invasion assay and cell colony formation assay were performed to assess the effect of CPG ODN2216 on the invasive properties of Panc-1 cells. Results: The TLR9 were high expressed in the pancreatic cancer tissue and pancreatic carcinoma cells. In vitro experiments as cell spreading assays、cell adhesion、colony formation assay and invasion assays showed the cell adhesion and cell motility properties of CPG ODN 2216 group were apparently weakened compared with theControl group. The MTT assay showed cell proliferation ability in the CPG ODN group was notably decrease, and CPG ODN2216 had inhibitive effects on growth of panc-1 cells in a dose and time-dependent manner.Conclusions:TLR9 gene is correlated with the invasive and metastatic potential of pancreatic carcinoma, and used of CPG ODN2216 induces the inhibition of migration and invasion of Panc-1 cell line.[Key Words] CPG ODN2216; Pancreatic neoplasms; Toll-like receptor 9;Oncogenesis近来发现toll样受体可能参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程[1]。而TLR9为该家族重要成员，能够刺激B细胞和树突状细胞分泌大量的细胞因子和趋化因子，如白介素(IL)-12、IL-6、干扰素-γ、单核细胞抑制蛋白和金属基质蛋白酶的表达[2]。很多肿瘤都出现TLR9高表达现象，为了研究TLR9基因在胰腺癌发生过程中所起的作用，在证实其在胰腺癌中高表达后，我们采用TLR9的特异性配体人工合成的寡脱氧核甘酸2216（CPG ODN2216）刺激胰腺癌细胞Panc-1,观察胰腺癌细胞的生长增殖、成瘤能力和侵袭能力等恶性表性方面的变化，验证TLR9基因在胰腺癌细胞发生和生长中所起的作用，为进一步研究TLR9基因的具体作用机制提供信息。1. 材料与方法一、 实验材料1. 细胞：人胰腺癌细胞Panc-1由华中科技大学同济医学院附属协和医院普外实验室提供，Panc-1用含10％胎牛血清、100μmoL/ml青链霉素的DMEM高糖培养液在5％CO2、37℃条件下培养。2. 组织切片：30例人新鲜胰腺癌组织及相应的癌旁组织（据肿瘤边缘1-2cm）取自胰腺癌患者，10例正常胰腺组织标本取自其他原因需行胰腺部分切除的非肿瘤患者，所有标本均为华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心接受手术治疗的胰腺癌患者且经术后病理证实。3. 主要试剂: CpG-ODN2216（序列GGGGGACGATCGTCGGGGGG），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代磷酸化修饰，PAGE纯化；TLR9单克隆抗体(cell signaling公司)。免疫组化及荧光试剂盒（武汉博士德公司）。Transwell小室（Coring公司）。Matrigel胶（Sigma公司）； MTT与DMSO（sigma公司）。二、 实验方法1. 免疫细胞荧光化学：用胰酶消化胰腺癌Panc-1细胞制成单细胞悬液，将单细胞悬液滴到玻片上。根据细胞生长状态，24小时或更长时间适时取出爬片。PBS漂洗三次，每次5min，用4%的多聚甲醛固定15min；PBS漂洗三次，用0.5%Triton穿孔20min；PBS漂洗三次，用5%BSA封闭30min；甩干液体后，直接加入稀释的一抗，对照组用PBS代替一抗。于4℃孵育过夜；PBS漂洗三次，加入稀释的二抗，于37℃孵育1h；PBS漂洗三次，加入稀释的SABC-FITC，于37℃孵育30min；PBS漂洗三次，水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。2. 免疫组织化学：石蜡切片脱蜡后，酒精水化。3％过氧化氢室温下浸泡10 min。切片在0.01moL枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中抗原修复。用5％山羊血清BSA室温封闭30 min，弃封闭液。加入适当稀释的一抗，对照组用PBS代替一抗，4℃过夜。PBS漂洗3遍，每遍5min；加生物素标记的二抗室温孵育30 min，PBS洗3遍；加入SABC，室温孵育30min。PBS清洗后DAB染色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜观察结果。3. 二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测胰腺癌细胞的增殖：将消化的胰腺癌细胞悬液按1×103/孔接种于96孔培养板中，每孔100μl。37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，24h细胞贴壁后，用不同浓度(0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)的CPG ODN2216作用细胞Panc-1,分别于培养后24h、48h、72h，加入浓度为5mg/ml的MTT20μl；培养4 h，弃上清，加入二甲基亚砜，150μl/孔，震动混匀，用酶标仪，在波长490nm处测定A值。抑制率=(A对照组-A药物组)/A对照组×100％[3]。绘增殖抑制曲线，测半数抑制浓度(IC50)。4. 划痕实验：将细胞浓度2×105/ml的Panc-1细胞悬液按每孔3ml加入6孔板，培养24h或更长时间，细胞生长达80％满后，弃培养液，加入浓度分别为1μg/ml、10μg/ml的CPG ODN2216的培养液，继续培养24h。弃上清，采用细胞刮刀在孔中央对细胞作一划痕，沿划痕边缘等距离间隔作4个标记作为数据测定点，测量时取平均值。PBS轻洗；加浓度分别为1μg/ml、10μg/ml的CPG ODN2216培养液继续培养，每6小时观察1次，测量各个时间点的划痕两侧细胞间的距离。5. 细胞黏附实验：96孔板铺胶，风干，BSA封阻，孵育60 min；将对照组及实验组(CPG ODN 1μg/ml、10μg/ml两种浓度干扰24 h)细胞浓度调整为(5×105)/ml，接种200μL/孔，孵育1h，PBS洗涤，加入浓度为5mg/ml MTT，培养4h；弃培养液，DMSO溶解20min；在波长490nm处测定A值；细胞黏附抑制率(％)=(A对照组-A药物组)/A对照组×100％。每组细胞设三个副孔，取平均值。6. 细胞侵袭实验：在Transwell上室膜上室侧加入30μL人工基底膜胶并风干，分别加入200μL（含1×105个细胞）饥饿培养24h的细胞，调整CPG ODN的浓度为1μg/ml、10μg/ml。在侵袭小室下室加500μL含10%FBS作为趋化因子的DMEM培养基，置37℃、5%CO2中培养。24h后取出小室，用棉签擦去上室中未转移的细胞和多余液体。将小室用4%多聚甲醛中固定10min，然后用1%结晶紫染色30min。去离子水充分洗膜。显微镜下观察并计数。每组细胞设三个副孔，取平均值。7. 细胞克隆实验：用胰酶消化Panc-1细胞，吹打制成单细胞悬液，接种于6孔板，约200个/孔，设为不加CPG组和浓度分别为1μg/ml、10μg/ml的CPG组，每组细胞设2个复孔。将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14 d。肉眼见到可见细胞克隆体后终止培养，去除培养液，PBS洗涤，苏木素染色30 min，PBS洗涤，计数细胞克隆形成率，数码照相照相。实验重复3次。8. 统计学分析：实验数据经SPSS13.0软件分析，所有数据用平均数±标准差表示，对各组实验数据之间差异是否有统计学意义进行t检验，P